HPLC多指標(biāo)成分定量與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的搜風(fēng)理肺丸質(zhì)量評(píng)價(jià)

馮婉紅，馬靈珍（.浙江中醫(yī)藥大學(xué)濱江學(xué)院附屬江南醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 30；.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 36800）

搜風(fēng)理肺丸是由桔梗、荊芥穗、黃芩等14味中藥材組方而成，臨床上主要用于外感風(fēng)寒、肺失宣降所致發(fā)熱惡寒、頭痛無(wú)汗、四肢酸軟、鼻塞流涕、咳嗽痰多、胸悶喘息等病癥的治療[1]。中藥復(fù)方制劑具有多組分、多靶點(diǎn)、多通道等特點(diǎn)，所含成分相互協(xié)同制約，對(duì)機(jī)體生物分子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行廣泛調(diào)節(jié)，以達(dá)到臨床治療效果。搜風(fēng)理肺丸現(xiàn)行質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[1]和文獻(xiàn)報(bào)道[2]僅對(duì)當(dāng)中黃芩苷進(jìn)行定量分析，未建立多指標(biāo)成分質(zhì)量控制方法，難以全面反映該制劑的整體產(chǎn)品質(zhì)量，直接影響臨床療效的穩(wěn)定性和一致性。多成分質(zhì)量控制模式能全面反映中成藥復(fù)方制劑的整體內(nèi)在質(zhì)量，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門不斷提升該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，完善藥材來(lái)源和制劑生產(chǎn)過(guò)程控制，以達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。本文以君臣佐使中醫(yī)配伍理論為依據(jù)，參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物的確認(rèn)原則，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定搜風(fēng)理肺丸中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素的含量，并采用聚類分析、主成分分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，為該制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

對(duì)照品黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素和白花前胡乙素來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110715-201821、112002-201702、111711-201904和111904-201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95.4%、98.5%、99.4%和98.9%。對(duì)照品去芹糖桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3來(lái)源于成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為PS010234和PS010235，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.8%和98.9%。對(duì)照品桔梗皂苷E和白花前胡E素來(lái)源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)分別為18030721和18031222，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.5%和99.9%。搜風(fēng)理肺丸（規(guī)格：9 g）分別來(lái)源于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠（批號(hào)分別為20013006、20013008、20013012、20013015、20013018、20013019和20013021，編號(hào)依次為S1～ S7）和桂林三金藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)分別為191007、191109和200302，編號(hào)依次為S8 ～ S10）。乙腈為色譜純，其它試劑為分析純。Waters 2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；BS110S型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-3200V型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 分別取去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素對(duì)照品適量，精密稱定，用60%甲醇制成濃度分別為0.128、0.194、0.106、3.854、0.698、0.622、0.156和0.272 mg·mL-1的混合對(duì)照品貯備液。精密吸取混合對(duì)照品貯備液1.0 mL，用60%甲醇稀釋至20 mL，制成去芹糖桔梗皂苷E 6.4 μg·mL-1、桔梗皂苷E 9.7 μg·mL-1、桔梗皂苷D35.3 μg·mL-1、黃芩苷192.7 μg·mL-1、漢黃芩苷34.9 μg·mL-1、白花前胡甲素31.1 μg·mL-1、白花前胡乙素7.8 μg·mL-1、白花前胡E素13.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取適量搜風(fēng)理肺丸，剪碎后取2.0 g，精密稱定，加入60%甲醇20 mL，對(duì)樣品進(jìn)行30 min的超聲處理，放冷后用60%甲醇稀釋至25 mL，混合均勻，過(guò)濾，制得搜風(fēng)理肺丸供試品溶液。取適量按搜風(fēng)理肺丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下處方比例和制法制得的缺桔梗、缺黃芩和缺前胡的陰性供試品，按上述方法制成陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件與專屬性實(shí)驗(yàn)

以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.9 mL·min-1；采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為210 nm（0 ～ 23 min檢測(cè)去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3）[3-4]、280 nm（24 ～ 34 min檢測(cè)黃芩苷和漢黃芩苷）[5-7]和321 nm（35 ～ 60 min檢測(cè)白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素）[8-9]。理論塔板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)應(yīng)≥ 4000。精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄所檢測(cè)色譜圖（圖1）。結(jié)果顯示，混合對(duì)照品和搜風(fēng)理肺丸供試品色譜圖中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素與相鄰色譜峰均能良好分離（分離度均＞1.5）；色譜峰峰形對(duì)稱，拖尾因子符合規(guī)定要求；陰性供試品對(duì)搜風(fēng)理肺丸中上述成分的同時(shí)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 HPLC色譜圖A - 混合對(duì)照品，B - 搜風(fēng)理肺丸供試品，C - 桔梗陰性供試品，D -黃芩陰性供試品，E - 前胡陰性供試品；1 - 去芹糖桔梗皂苷E，2 -桔梗皂苷E，3 - 桔梗皂苷D3，4 - 黃芩苷，5 - 漢黃芩苷，6 - 白花前胡甲素，7 - 白花前胡乙素，8 - 白花前胡E素Fig 1 HPLC chromatogramA - mixed reference, B - Soufeng Lifei pills sample, C - negative sample without platycodonis radix, D - negative sample without scutellaria radix, E - negative sample without peucedanum radix; 1 -deapi-platycoside E, 2 - platycoside E, 3 - platycodin D3, 4 - baicalin,5 - wogonoside, 6 - praeruptorin A, 7 - praeruptorin B, 8 - praeruptorin E

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，分別用60%甲醇稀釋至20 mL，制得系列質(zhì)量濃度溶液，各取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素的峰面積，以峰面積為Y軸，質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為X軸進(jìn)行回歸，得回歸方程和線性范圍，見(jiàn)表1。

表1 搜風(fēng)理肺丸中8種成分的回歸方程、r和線性范圍Tab 1 Regressive equations、correlation coefficients and linear ranges of eight components in Soufeng Lifei pills

2.3.2 精密度 取同一份搜風(fēng)理肺丸（編號(hào)：S1）供試品溶液進(jìn)樣10 μL，測(cè)定8種成分的峰面積，測(cè)得各成分峰面積的RSD分別為1.20%、1.07%、1.42%、0.55%、0.71%、0.68%、0.81%、1.05%。

2.3.3 重復(fù)性 取同一批次搜風(fēng)理肺丸（編號(hào)：S1），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)操作6次，各取10 μL進(jìn)樣測(cè)定8種成分的峰面積，計(jì)算得各成分含量的RSD分別為1.76%、1.69%、1.87%、0.96%、1.25%、1.32%、1.61%、1.79%。

2.3.4 穩(wěn)定性 取一份搜風(fēng)理肺丸（編號(hào)：S1）供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h各進(jìn)樣10 μL，檢測(cè)8種成分的峰面積，結(jié)果顯示搜風(fēng)理肺丸供試品溶液24 h穩(wěn)定，各成分峰面積的RSD分別為1.13%、1.22%、1.39%、0.60%、0.88%、0.75%、0.89%、1.12%。

2.3.5 加樣回收率 取已知去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素含量的搜風(fēng)理肺丸（編號(hào)：S1）9份，每份1.0 g，精密稱定，隨機(jī)平分成3組，精密加入混合對(duì)照品溶液（去芹糖桔梗皂苷E 0.086 mg·mL-1、桔梗皂苷E 0.138 mg·mL-1、桔梗皂苷D30.054 mg·mL-1、黃芩苷2.852 mg·mL-1、漢黃芩苷0.496 mg·mL-1、白花前胡甲素0.432 mg·mL-1、白花前胡乙素0.118 mg·mL-1、白花前胡E素0.174 mg·mL-1）0.5、1.0、1.5 mL各一組，再按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成加樣供試品溶液。精密吸取上述9份溶液各10 μL，進(jìn)樣檢測(cè)8種成分的峰面積，計(jì)算得8種成分平均加樣回收率分別為98.70%、97.97%、96.95%、100.10%、99.22%、99.78%、97.73%、98.05%，RSD分別為1.41%、1.38%、0.97%、0.89%、1.00%、0.83%、1.26%、1.52%（n= 9）。

2.4 樣品含量測(cè)定

取搜風(fēng)理肺丸樣品10批，每批次按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備搜風(fēng)理肺丸供試品溶液3份，各進(jìn)樣10 μL檢測(cè)去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素的峰面積，計(jì)算得8種目標(biāo)化合物的含量，見(jiàn)表2。

表2 搜風(fēng)理肺丸中8種成分的含量測(cè)定結(jié)果. mg·g-1，n = 3Tab 2 The content results of eight components in Soufeng Lifei pills. mg·g-1, n = 3

2.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.5.1 聚類分析 將“2.4”項(xiàng)下10個(gè)批次搜風(fēng)理肺丸中8種成分含量測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0軟件中，采用組間聯(lián)接聚類方法，以歐氏距離為測(cè)度，對(duì)10個(gè)批次搜風(fēng)理肺丸樣品進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)類間距離為15時(shí)，10批搜風(fēng)理肺丸樣品聚為2類，樣品S4、S6、S5、S1、S7、S2和S3聚為第Ⅰ類，樣品S8、S10和S9聚為第Ⅱ類。從分類結(jié)果來(lái)看，同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的搜風(fēng)理肺丸樣品歸為一類，表明同一生產(chǎn)企業(yè)所生產(chǎn)樣品產(chǎn)品質(zhì)量較為穩(wěn)定，不同企業(yè)間樣品存在一定的質(zhì)量差異，可能與搜風(fēng)理肺丸所用原藥材源頭控制和制劑生產(chǎn)過(guò)程參數(shù)控制等因素差異有關(guān)。

2.5.2 主成分分析 將“2.4”項(xiàng)下10個(gè)批次搜風(fēng)理肺丸中8種成分含量測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0軟件中，對(duì)10批搜風(fēng)理肺丸樣品進(jìn)行主成分分析，以累積方差貢獻(xiàn)率＞ 85%、初始特征值＞ 1為提取標(biāo)準(zhǔn)，主成分分析結(jié)果顯示前4個(gè)主成分特征值分別為2.476、2.110、1.616和1.135，均＞ 1，曲線陡峭，后4個(gè)主成分特征值均＜ 1，曲線較為平緩，前4個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率分別為30.949%、26.373%、20.206%和14.189%，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到91.717%，表明提取前4個(gè)主成分較為合理，能夠代表搜風(fēng)理肺丸中的大部分信息。成分矩陣結(jié)果顯示白花前胡E素、去芹糖桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3對(duì)主成分1貢獻(xiàn)較大，桔梗皂苷E和黃芩苷對(duì)主成分2貢獻(xiàn)較大，漢黃芩苷和白花前胡乙素對(duì)主成分3貢獻(xiàn)較大，白花前胡甲素對(duì)主成分4貢獻(xiàn)較大。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化選擇

在搜風(fēng)理肺丸定量測(cè)定中，本實(shí)驗(yàn)參考去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素被檢測(cè)所用流動(dòng)相的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)比考察了甲醇-水[8]、甲醇-0.05%磷酸溶液[2]、乙腈-水[3-4,10]、乙腈-0.1%磷酸溶液[5]、乙腈-0.1%三氟乙酸溶液[6]、乙腈-0.1%甲酸溶液[7]等流動(dòng)相體系對(duì)色譜峰分離效果的影響。結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，所測(cè)8種目標(biāo)化合物色譜峰的峰形較好，基線較為平穩(wěn)。通過(guò)對(duì)流動(dòng)相比例的不斷摸索優(yōu)化，最終確定流動(dòng)相程序?qū)λ扬L(fēng)理肺丸8種成分含量進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

3.2 目標(biāo)化合物的選擇

搜風(fēng)理肺丸由荊芥穗、紫蘇梗、薄荷、前胡、陳皮、去皮炒苦杏仁、桔梗、去瓤麩炒枳殼、旋復(fù)花、竹茹、法半夏、蜜炙瓜萎子、黃芩和甘草14味中藥材組方而來(lái)，所含成分共同作用，以達(dá)清熱解表、宣肺止咳之功。中成藥復(fù)方制劑所含成分復(fù)雜，其藥理作用和臨床治療效果是所有藥材共同作用的結(jié)果，多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)模式能夠較為全面地評(píng)價(jià)其產(chǎn)品質(zhì)量，本文依據(jù)君藥所含成分為首選，同時(shí)做到兼顧臣佐使藥所含成分，選取方中君藥桔梗所含特征成分去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3，臣藥黃芩所含藥效成分黃芩苷和漢黃芩苷，以及佐藥前胡所含代表性成分白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡E素為定量控制指標(biāo)成分，以期為全面評(píng)價(jià)搜風(fēng)理肺丸整體質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)搜風(fēng)理肺丸中去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、黃芩苷、漢黃芩苷、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素含量進(jìn)行了定量控制，首次建立了該制劑多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，同時(shí)對(duì)所測(cè)8種成分的含量結(jié)果采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行了聚類分析和主成分分析。所建立的方法符合定量分析要求，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，從含量檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，搜風(fēng)理肺丸中所測(cè)成分含量存在一定的批間差異，表明建立多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)模式有利于確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性；從化學(xué)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果來(lái)看，同一生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品較為穩(wěn)定，不同企業(yè)間產(chǎn)品差異較大，可能與各生產(chǎn)企業(yè)對(duì)制劑生產(chǎn)所用原藥材的種屬來(lái)源、產(chǎn)地、種植方式、采收季節(jié)、加工方法等因素差異以及制劑生產(chǎn)過(guò)程控制有關(guān)，提示藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門及時(shí)關(guān)注產(chǎn)品質(zhì)量源頭控制和生產(chǎn)過(guò)程控制，逐步完善制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和原藥材內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，以確保搜風(fēng)理肺丸產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效的穩(wěn)定性，更好地為臨床合理用藥提供保障。