基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討苓術(shù)菟絲子丸治療腎性蛋白尿的作用機(jī)制

陶 杰，徐川嵐，明 瑤，趙 莎，沈宏春,2#

(1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川 瀘州 646000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院中醫(yī)診斷學(xué)教研室，四川 瀘州 646000)

苓術(shù)菟絲丸為中醫(yī)方劑，出自《景岳全書(shū)》卷五十一，全方由白茯苓、白術(shù)、蓮肉、五味子、山藥、杜仲、炙甘草及菟絲子8味中藥組成。苓術(shù)菟絲子丸在臨床應(yīng)用中對(duì)于腎性蛋白尿的治療有確切的療效，但其組方成分復(fù)雜，治療腎性蛋白尿的機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是現(xiàn)代科技發(fā)展下的產(chǎn)物，其通過(guò)把藥理學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)合，通過(guò)對(duì)藥物活性成分的預(yù)測(cè)及其靶點(diǎn)的篩選、分析[1-2]，構(gòu)建藥物活性成分與作用靶點(diǎn)間的生物信息網(wǎng)絡(luò)，找出其相互關(guān)系及作用機(jī)制[3]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的途徑，篩選苓術(shù)菟絲子丸的藥物活性成分及靶點(diǎn)，構(gòu)建“苓術(shù)菟絲子丸活性成分-腎性蛋白尿作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步探討苓術(shù)菟絲子丸治療腎性蛋白尿提供方向。

1 資料與方法

1.1 活性成分的篩選及靶點(diǎn)挖掘

分別以苓術(shù)菟絲子丸中的主要組方藥物“菟絲子”“杜仲”“白術(shù)”“茯苓”“山藥”“蓮肉”“五味子”及“炙甘草”為檢索詞，通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，查找組方藥物的活性成分及其靶點(diǎn)。將篩選條件限定為：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.15，過(guò)濾掉重復(fù)的靶點(diǎn)，得到藥物活性成分?jǐn)?shù)據(jù)集及藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.2 腎性蛋白尿相關(guān)靶點(diǎn)獲取

以“Renal proteinuria”為檢索詞分別從人類孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http://www.omim.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中獲取腎性蛋白尿的相關(guān)靶點(diǎn)，過(guò)濾掉重復(fù)的靶點(diǎn)，得到腎性蛋白尿相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 Venn分析及“藥物-靶點(diǎn)-疾病”數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

將藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集和疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集導(dǎo)入txt.文本文件中，通過(guò)R語(yǔ)言程序運(yùn)算進(jìn)行Venn分析，得到兩者共同作用的靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)String在線(http: //string-db. org)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，物種選擇“Homo sapiens”，顯示苓術(shù)菟絲子丸與腎性蛋白尿的靶向關(guān)系。

1.4 “活性成分-疾病-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

基于“活性成分-疾病-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Cytoscape 3.6.1(http: //www. cytoscape. org)軟件進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可視化處理，構(gòu)建“活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，探討苓術(shù)菟絲子丸的藥理學(xué)作用機(jī)制。

基于上述數(shù)據(jù)及步驟，再運(yùn)用Cytoscape軟件中的“Network Analyzer”插件進(jìn)行拓?fù)浞治?。以度、介度中心度、接近中心度的均值作為分界點(diǎn)，篩選出的數(shù)值在均值以上的靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

將“活性成分-疾病-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO功能富集分析，從而得到基因的功能水平分析結(jié)果，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)Cytoscape 3.6.1軟件在KEGG通路富集分析中尋找信號(hào)通路(FDR<0.01)并構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及靶蛋白的篩選

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，共檢索出苓術(shù)菟絲子丸藥物活性成分197個(gè)，即菟絲子11個(gè)，杜仲28個(gè)，白術(shù)8個(gè)，茯苓15個(gè)，山藥16個(gè)，蓮子12個(gè)，五味子13個(gè)，炙甘草94個(gè)。重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1個(gè)，篩選出滿足條件的藥物活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共138個(gè)。苓術(shù)菟絲子丸部分活性成分見(jiàn)表1(由于苓術(shù)菟絲子丸組方藥物所篩選出的活性成分較多，每個(gè)藥物僅列舉部分活性成分)。

表1 苓術(shù)菟絲子丸的部分活性成分Tab 1 Some active components of Semen cuscutae pills of Lingzhu

2.2 疾病靶點(diǎn)獲取結(jié)果

從OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲取到22、2 460個(gè)腎性蛋白尿相關(guān)靶點(diǎn)。過(guò)濾掉重復(fù)的靶點(diǎn)，共得到2 479個(gè)腎性蛋白尿相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 Venn圖及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將苓術(shù)菟絲子丸138個(gè)靶點(diǎn)與腎性蛋白尿2 479個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行Venn分析，得到75個(gè)交集的靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。將75個(gè)交集靶點(diǎn)通過(guò)String軟件進(jìn)行蛋白互作關(guān)系的處理，并使用Cytoscape 軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示，共有74個(gè)節(jié)點(diǎn)，629條邊，見(jiàn)圖2。選取基因連接節(jié)點(diǎn)數(shù)量排名前30條繪制可視化柱狀圖，包括白細(xì)胞介素6(IL-6)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) 及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)等，見(jiàn)圖3。

圖1 藥物活性成分與腎性蛋白尿靶點(diǎn)的Venn圖Fig 1 Venn diagram of drug active components and renal proteinuria target

圖3 PPI可視化柱狀圖Fig 3 Visualized histogram of PPI

2.4 “活性成分-疾病-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

使用Cytoscape對(duì)“活性成分-疾病-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，以顯示苓術(shù)菟絲子丸活性成分與腎性蛋白尿靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，見(jiàn)圖4(其中六邊形代表腎性蛋白尿，三角形代表中藥復(fù)方苓術(shù)菟絲子丸，菱形代表腎性蛋白尿的疾病靶點(diǎn)，長(zhǎng)方形代表苓術(shù)菟絲子丸中組方的活性成分)。網(wǎng)絡(luò)圖顯示，連接靶點(diǎn)數(shù)前5位從高到低為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、異鼠李素(isorhamnetin)及木犀草素(luteolin)。

圖4 “活性成分-疾病-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Interaction network diagram of “active component—disease—target”

通過(guò)拓?fù)浞治隹芍?，度的均值約為15.79，介度中心度的均值約為0.01，接近中心度的均值約為0.411。通過(guò)篩選，度、介度中心度、接近中心度數(shù)值在均值以上的靶點(diǎn)共有11個(gè)，見(jiàn)表2。

表2 核心靶點(diǎn)拓?fù)浞治鰠?shù)Tab 2 Parameters of topologic alanalysis of core targets

2.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)將苓術(shù)菟絲子丸與腎性蛋白尿的交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。將P值設(shè)定為<0.05，并按照富集基因數(shù)從大到小排序，選取排序居前20位的生物過(guò)程和通路。(1)通過(guò)苓術(shù)菟絲子丸的GO功能富集分析，共查詢到93個(gè)條目，篩選出數(shù)量排序居前20位的生物過(guò)程，見(jiàn)圖5；GO富集分析點(diǎn)圖見(jiàn)圖6。其中包括核受體活性(nuclear receptor activity)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄(RNA polymerase II transcription factor binding)、激素受體結(jié)合(steroid hormone receptor activity；estrogren receptor binding)以及氧化還原反應(yīng)(oxidoreductase activity，acting on CH-OH group of donors)等。(2)通過(guò)苓術(shù)菟絲子丸的KEGG通路富集分析，共查詢到119個(gè)條目，篩選出數(shù)量排序居前20位的通路，見(jiàn)圖7；KEGG通路富集分析點(diǎn)圖見(jiàn)圖8。其中包括腫瘤信號(hào)通路(Prostate cancer；Colorectal cancer)、細(xì)胞凋亡過(guò)程(Apoptosis)以及腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)等。以上結(jié)果提示，苓術(shù)菟絲子丸可能通過(guò)多條信號(hào)通路對(duì)腎性蛋白尿起治療作用。

圖5 苓術(shù)菟絲子丸治療腎性蛋白尿靶點(diǎn)GO富集分析柱狀圖Fig 5 Histogram of GO enrichment analysis on targets of Semen cuscutae pills of Lingzhu in the treatment of renal proteinuria

圖6 苓術(shù)菟絲子丸治療腎性蛋白尿靶點(diǎn)GO富集分析點(diǎn)圖Fig 6 Point diagram of GO enrichment analysis on targets of Semen cuscutae pills of Lingzhu in the treatment of renal proteinuria

圖7 苓術(shù)菟絲子丸治療腎性蛋白尿靶點(diǎn)KEGG富集分析柱狀圖Fig 7 Histogram of KEGG enrichment analysis on targets of Semen cuscutae pills of Lingzhu in the treatment of renal proteinuria

圖8 苓術(shù)菟絲子丸關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG富集分析點(diǎn)圖Fig 8 Point diagram of KEGG enrichment analysis on key targets of Semen cuscutae pills of Lingzhu

3 討論

中藥復(fù)方組方成分復(fù)雜，目前其作用的途徑及作用機(jī)制尚未闡明[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在一定程度上與中醫(yī)系統(tǒng)、整體理論相契合，可以構(gòu)建藥物活性成分與疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，能夠作為預(yù)測(cè)藥物作用機(jī)制的有效途徑[5]。

中醫(yī)認(rèn)為，腎為封藏之本，腎之藏泄失司，使腎精不藏，人體之精微物質(zhì)外泄，而成腎性蛋白尿[6]。腎性蛋白尿總屬本虛標(biāo)實(shí)，以腎虛為本，故治療上應(yīng)以調(diào)和腎之陰陽(yáng)，補(bǔ)腎固精為法則。苓術(shù)菟絲子丸中，茯苓淡滲利濕，以泄腎濁；五味子滋陰補(bǔ)腎；白術(shù)、山藥、蓮肉和甘草益氣健脾；杜仲、菟絲子補(bǔ)腎益精；全方具有補(bǔ)腎固精之功效，補(bǔ)腎與固精相結(jié)合，以補(bǔ)為主，使腎之封藏有序，精微得以固攝。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了苓術(shù)菟絲子丸藥物活性成分與腎性蛋白尿靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，篩選出藥物活性成分有138個(gè)，網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中連接靶點(diǎn)最多的包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素及豆甾醇等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素可以通過(guò)調(diào)節(jié)氧化系統(tǒng)，對(duì)血管產(chǎn)生保護(hù)作用[7-8]。研究結(jié)果顯示，山柰酚能夠抑制細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎臟功能[9-10]。β-谷甾醇在嚙齒動(dòng)物的特定和非特定類型的急性炎癥中具有抗炎功能[11]。異鼠李素通過(guò)抑制NF-κB通路的過(guò)度活化、降低炎癥因子水平，以減少蛋白尿[12]。木犀草素能夠降低氧化應(yīng)激、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥反應(yīng)和腎細(xì)胞凋亡等[13-15]?？梢?jiàn)，苓術(shù)菟絲子丸中的藥物活性成分有抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)以及降低氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用，對(duì)減少蛋白尿的排泄起著重要作用。

苓術(shù)菟絲子丸與腎性蛋白尿共同作用的靶點(diǎn)共有75個(gè)，PPI網(wǎng)絡(luò)顯示連接數(shù)量較多的有：IL-6、CASP3、VEGF及EGFR等。其中IL-6參與炎癥及內(nèi)皮損傷的過(guò)程，還可以引起脂質(zhì)代謝的異常，對(duì)于腎病的發(fā)展有重要的影響[16-18]。CASP3用于早期篩查及監(jiān)測(cè)腎臟損傷[19]。VEGF與腎臟微血管病變有著密切的聯(lián)系，對(duì)于腎小球?yàn)V過(guò)屏障產(chǎn)生有益的影響[20]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎病模型中腎小球的臟層上皮有EGFR的表達(dá)[21]；此外，有研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)EGFR參與調(diào)節(jié)炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]。由此可以推測(cè)，苓術(shù)菟絲子丸可能通過(guò)對(duì)上述靶點(diǎn)產(chǎn)生影響，從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷等，以治療腎性蛋白尿。

通過(guò)篩選，得出KEGG顯著富集前20條通路，如：腫瘤信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡過(guò)程、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、激素受體結(jié)合以及氧化還原反應(yīng)等。其中TNF-α信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)相關(guān)[23]；雌激素受體α對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子有增強(qiáng)的作用[24]，HIF-1信號(hào)通路的激活參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展進(jìn)程[25]；RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞凋亡過(guò)程會(huì)使腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，從而導(dǎo)致腎臟組織結(jié)構(gòu)的改變，干預(yù)細(xì)胞凋亡能減緩腎臟纖維化[24，26-27]。結(jié)果提示，苓術(shù)菟絲子丸治療腎性蛋白尿可能通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮再生、氧化還原反應(yīng)和細(xì)胞凋亡與增殖，調(diào)控激素受體等方面來(lái)發(fā)揮作用。

目前，對(duì)于苓術(shù)菟絲子丸的臨床及實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)資料有限，尚無(wú)法對(duì)苓術(shù)菟絲子丸治療腎性蛋白尿的預(yù)測(cè)通路進(jìn)行評(píng)估及驗(yàn)證。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討了苓術(shù)菟絲子丸治療腎性蛋白尿的藥物活性成分、靶點(diǎn)和機(jī)制，以期為下一步機(jī)制研究及臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)和參考。