人臍帶間充質(zhì)干細胞通過線粒體轉(zhuǎn)移減輕肝細胞缺血-再灌注損傷的機制研究

單佳柔 尼貝貝 李翠平 徐睿璇 陳文捷

肝缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指在肝移植過程中，阻斷肝臟血流一段時間后，重新開放血流造成的損傷，其在臨床肝移植手術(shù)中發(fā)生率較高，可造成術(shù)后一系列并發(fā)癥如膽道、血管并發(fā)癥等[1-2]，是導(dǎo)致肝移植術(shù)后受者生存率降低的主要因素。

人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，HUC-MSC）具有排斥性低、來源廣泛、獲取簡便等優(yōu)點，在免疫治療方面有著非常廣闊的應(yīng)用前景[3]。既往研究中已有數(shù)據(jù)表明，間充質(zhì)干細胞移植可改善肝功能，在多種肝臟疾病模型中都表現(xiàn)出了減輕肝臟損傷、降低炎癥水平的作用，在臨床研究中也表現(xiàn)出一定的療效[4-6]。然而在不同的研究中，采用間充質(zhì)干細胞治療的細胞數(shù)量尚無定論。

近年來，研究者對于間充質(zhì)干細胞基于線粒體的直接接觸作用展開了一系列研究。目前研究表明，隧道納米管（tunneling nanotube，TNT）是細胞間信息交流與物質(zhì)傳遞的一種新渠道，線粒體可以通過這種方式進行轉(zhuǎn)移，從而減輕器官損傷[7-10]。本研究通過氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）的方式培養(yǎng)正常人肝細胞株L02建立IRI模型，并使用不同濃度的HUC-MSC干預(yù)，觀察不同濃度HUC-MSC對肝細胞IRI的直接作用，以期為優(yōu)化臨床肝移植術(shù)后的缺血并發(fā)癥治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

正常人肝細胞株L02為筆者實驗室保存的細胞株。HUC-MSC來源于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生物治療中心，已通過干細胞質(zhì)量檢測，符合相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器

高糖Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）、無糖DMEM、胰酶、磷酸鹽緩沖液均購自美國Gibco公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自德國PAN公司。細胞凋亡試劑盒AnnixinV-APC/PI購自江蘇凱基公司。人源堿性成纖維細胞生長因子購自美國PeproTech公司。CellTrace Violet、MitoSOX Red、MitoTracker Deep Red 均購自美國Thermo Fisher公司。Phaliodinifluor 488購自英國Abcam公司。

1.3 IRI模型建立和分組

通過OGD的方式進行細胞培養(yǎng)建立IRI模型。使用無糖無血清DMEM在低氧培養(yǎng)箱（1% O2，5%CO2）培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基（高糖DMEM+10%FBS）在正常培養(yǎng)箱（5% CO2）培養(yǎng)2 h。未建立IRI模型的細胞使用高糖DMEM+10%FBS在正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。

細胞分組：將L02分為空白對照組、OGD組、實驗對照組和L02與HUC-MSC共培養(yǎng)組（L02+HUC-MSC組）。其中L02+HUC-MSC組將L02與HUC-MSC根據(jù)不同比例共培養(yǎng)，分為10:1共培養(yǎng)組（A組）、4:1共培養(yǎng)組（B組）、2:1共培養(yǎng)組（C組）、1:1共培養(yǎng)組（D組）和1:2共培養(yǎng)組（E組）?？瞻讓φ战M為L02單獨培養(yǎng)未建立IRI模型。OGD組為L02單獨培養(yǎng)建立IRI模型。實驗對照組為L02與HUC-MSC按照1:1的比例直接共培養(yǎng)12 h，未建立IRI模型。L02+HUC-MSC組中，將L02與HUC-MSC按照上述不同比例直接共培養(yǎng)12 h后，建立IRI模型。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞內(nèi)活性氧簇相對量和細胞凋亡率檢測 空白對照組、OGD組及A～E組細胞采用細胞膜染料CellTrace Violet標(biāo)記L02，染色結(jié)束后洗去染料正常培養(yǎng)12 h，再與未標(biāo)記的HUC-MSC按照不同比例直接共培養(yǎng)后，采用流式細胞術(shù)分析。按照試劑盒使用說明書，各組細胞分別用MitoSOX Red、Annexin V-APC/PI孵育，以檢測細胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）相對量及細胞凋亡率。

1.4.2 細胞間線粒體轉(zhuǎn)移檢測 實驗對照組和A～E組細胞分別采用CellTrace Violet標(biāo)記L02和線粒體靶向染料MitoTracker Deep Red標(biāo)記HUC-MSC，染色結(jié)束后洗去染料正常培養(yǎng)12 h，再按照不同比例直接共培養(yǎng)后，采用流式細胞術(shù)測定L02的MitoTracker陽性率。

1.4.3 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞間線粒體轉(zhuǎn)移Phalloidin-ifluor 488是F-actin的一種特異性染料，用Phaliodin-ifluor 488對共培養(yǎng)細胞進行染色可使含有F-actin的TNT發(fā)出綠色熒光。采用激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）觀察C組HUC-MSC與L02細胞間線粒體轉(zhuǎn)移情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析；采用GraphPad Prism 5軟件進行繪圖分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HUC-MSC對L02細胞凋亡和細胞內(nèi)ROS的影響

將CellTrace Violet標(biāo)記的L02與未標(biāo)記的HUC-MSC直接共培養(yǎng)后，采用流式細胞術(shù)分析，CellTrace Violet陽性為L02，CellTrace Violet陰性為HUC-MSC（圖1A）。各組L02細胞凋亡率見圖1B。OGD組L02細胞凋亡率為59%，高于空白對照組的5%（P＜0.05）。將L02與HUC-MSC直接共培養(yǎng)后，L02細胞凋亡率降低，A、B、C組L02細胞凋亡率分別為50%、43%、37%，與OGD組比較，B組和C組L02細胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＜0.05）；而繼續(xù)升高HUC-MSC的比例，L02細胞凋亡率逐漸升高，D組和E組L02細胞凋亡率分別為42%和47%，但仍低于OGD組（均為P＜0.05）。各組L02細胞內(nèi)ROS相對量見圖1C。OGD組L02細胞內(nèi)ROS相對量較空白對照組升高（P＜0.05），將L02與HUC-MSC直接共培養(yǎng)后，E組L02細胞內(nèi)ROS相對量較OGD組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組L02細胞凋亡率和細胞內(nèi)ROS相對量的比較Figure 1 Comparison of cell apoptosis rate and intracellular relative ROS level of L02 cells among each group

2.2 HUC-MSC向L02轉(zhuǎn)移線粒體的流式細胞學(xué)表現(xiàn)

將L02用CellTrace Violet標(biāo)記，HUC-MSC用線粒體靶向染料MitoTracker Deep Red標(biāo)記，采用流式細胞術(shù)分析，CellTrace Violet陽性為L02，MitoTracker陽性為HUC-MSC（圖2A）。HUC-MSC 向L02轉(zhuǎn)移線粒體的情況見圖2B、C。A組 L02的MitoTracker陽性率為31%，與實驗對照組（30%）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；繼續(xù)升高HUC-MSC的比例，B、C、D、E組L02的MitoTracker陽性率均較實驗對照組增加（均為P＜0.05），B、C、D組分別為46%、71%、91%，E組中幾乎全部L02都表現(xiàn)出MitoTracker陽性。結(jié)果表明在IRI刺激下，線粒體會大量從HUC-MSC轉(zhuǎn)移到L02，并呈濃度依賴性。

圖2 HUC-MSC 向L02轉(zhuǎn)移線粒體的流式細胞學(xué)表現(xiàn)Figure 2 Flow cytometry findings of mitochondrial transfer from HUC-MSC to L02 cells

2.3 HUC-MSC向L02轉(zhuǎn)移線粒體的激光共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)

采用MitoTracker Deep Red標(biāo)記HUC-MSC（圖3A），CellTrace Violet標(biāo)記L02（圖3B），再用Phaliodinifluor 488對共培養(yǎng)細胞進行染色（圖3C），激光共聚焦顯微鏡下可見包含HUC-MSC線粒體的TNT狀結(jié)構(gòu)連接HUC-MSC和L02，有紅色的線粒體通過并存在于兩種細胞中（圖3D、E）。結(jié)果揭示了HUCMSC和L02細胞骨架之間的聯(lián)系，進一步證實了線粒體從HUC-MSC轉(zhuǎn)移至L02。

圖3 HUC-MSC向L02轉(zhuǎn)移線粒體的激光共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)Figure 3 Mitochondrial transfer from HUC-MSC to L02 cells under the confocal laser scanning microscopy

3 討 論

肝臟IRI過程中發(fā)生的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等會損害肝功能，造成局部出血、壞死。在缺血階段，肝竇內(nèi)皮細胞首先受到影響，被誘導(dǎo)發(fā)生程序性細胞死亡，由此導(dǎo)致了肝臟內(nèi)血竇結(jié)構(gòu)破壞和血栓形成，從而引發(fā)一系列免疫損傷[11-13]。再灌注階段造成的損傷更為嚴重，肝臟固有免疫應(yīng)答被激活，誘導(dǎo)中性粒細胞浸潤并協(xié)同枯否細胞共同發(fā)揮損傷作用[14-15]。干細胞移植在缺血性疾病中表現(xiàn)出了一定的治療效果，已有研究表明HUC-MSC來源的外泌體和細胞外囊泡可通過降低氧化應(yīng)激水平，減輕中性粒細胞浸潤來緩解大鼠肝臟IRI[16-17]。從HUC-MSC中分離的線粒體可在一定程度上恢復(fù)局部缺血所致腦卒中小鼠的運動機能[18]。Bi等[19]研究表明間充質(zhì)干細胞可延緩小鼠肝臟纖維化的進展，對終末期肝硬化起到了一定的治療作用。在相關(guān)的臨床試驗中亦發(fā)現(xiàn)，注射自體骨髓間充質(zhì)干細胞可恢復(fù)患者肝功能和減輕肝臟纖維化程度[20-21]。

本研究通過OGD的方式培養(yǎng)L02建立IRI模型，通過HUC-MSC和L02體外直接共培養(yǎng)來探究不同濃度HUC-MSC對肝細胞IRI的作用。在L02+HUCMSC共培養(yǎng)組中，隨著HUC-MSC濃度升高，L02細胞凋亡率下降，L02與HUC-MSC共培養(yǎng)比例2:1時，HUC-MSC減輕L02細胞凋亡的作用最佳，細胞凋亡率為37%；而在L02與HUC-MSC共培養(yǎng)比例為1:2的情況下，細胞凋亡率為47%（P＜0.05）。表明在HUC-MSC的損傷修復(fù)作用中，細胞移植濃度是一個關(guān)鍵影響因素。

線粒體是組織損傷，尤其是IRI的一個重要靶點[22-24]。Gu等[25]的研究表明在IRI期間，線粒體自噬在線粒體功能和肝細胞存活中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在IRI過程中，細胞內(nèi)ROS大量累積，產(chǎn)生離子交換異常，導(dǎo)致線粒體功能下降甚至線粒體破裂[26-28]。本研究中，IRI后的L02細胞內(nèi)ROS相對量較對照組升高（P＜0.05），L02和HUC-MSC直接共培養(yǎng)后低濃度HUC-MSC條件下ROS相對量變化較小，而升高HUC-MSC濃度，共培養(yǎng)比例1:2時HUC-MSC才起到了降低ROS相對量的作用（P＜0.05）。HUC-MSC降低氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS水平相對有限，Johnson等[29]提出在治療慢性阻塞性肺疾病方面，無靶向性的抗氧化劑（例如N-乙酰半胱氨酸）的臨床功效有限。Li等[30]的研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細胞來源的間充質(zhì)干細胞（induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell，iPSC-MSC）可以通過線粒體轉(zhuǎn)移的方式減輕氣道損傷及炎癥反應(yīng)，但iPSC-MSC對損傷細胞內(nèi)ROS水平的調(diào)節(jié)作用有限。說明HUCMSC的保護作用可能不是通過一般的抗氧化作用，而是通過向受損細胞轉(zhuǎn)移線粒體，特異性恢復(fù)線粒體功能，改善細胞生理狀態(tài)。本研究觀察到連接HUCMSC和L02的細胞骨架中TNT形成，TNT是高度敏感的納米管結(jié)構(gòu)，可促進囊泡和細胞器在細胞之間的選擇性轉(zhuǎn)移。IRI刺激后，線粒體從HUC-MSC向L02轉(zhuǎn)移，隨著HUC-MSC的濃度升高，線粒體的轉(zhuǎn)移率也逐漸提高，在L02和HUC-MSC共培養(yǎng)比例1:1的情況下，90%以上的L02都表現(xiàn)出了HUCMSC線粒體陽性，結(jié)合HUC-MSC對L02細胞凋亡的保護作用，可認為其線粒體轉(zhuǎn)移率在一定范圍內(nèi)與對L02細胞凋亡的保護作用呈正相關(guān)。

綜上所述，HUC-MSC可通過細胞間直接轉(zhuǎn)移線粒體的方式減輕IRI后L02細胞凋亡和降低細胞內(nèi)ROS水平，不同濃度HUC-MSC對肝細胞IRI的直接保護作用有所差異，呈一定的濃度依賴性。關(guān)于HUC-MSC濃度對損傷修復(fù)作用的影響機制有待進一步探討。