不同施肥條件下的小麥籽粒代謝組學(xué)研究

賁蓓倍,徐維紅,鄒德玉,牟美睿,楊仁杰,劉海學(xué)

(1.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384;2.天津市植物保護(hù)研究所，天津 300112)

肥料是影響農(nóng)作物代謝過程的重要因素[1]。有研究表明，肥料能讓小麥在生育期間保持較高的光合水平[2]，優(yōu)化冠層結(jié)構(gòu)[3]，使碳化合物積累量增加，并促使同化產(chǎn)物向穗部轉(zhuǎn)運(yùn)[4]，最終對(duì)籽粒中代謝物的含量和類型產(chǎn)生影響。氮肥是影響小麥生長(zhǎng)發(fā)育的首要養(yǎng)分因子。孫麗敏等[5]發(fā)現(xiàn)，氮肥對(duì)4個(gè)類型生態(tài)區(qū)冬小麥產(chǎn)量效應(yīng)最大。小麥蛋白質(zhì)和淀粉的合成代謝在受氮影響顯著[6]。目前，在小麥生產(chǎn)過程中存在濫用氮肥、氮肥利用率下降、施肥不合理等現(xiàn)象[7-8]，加之氮肥種類眾多[9-10]，使農(nóng)戶難以抉擇。合理的氮肥運(yùn)籌對(duì)小麥生產(chǎn)極為重要。

代謝組學(xué)是一門新興學(xué)科，主要是通過生物體受到環(huán)境影響后小分子代謝物的動(dòng)態(tài)變化來反映生物體內(nèi)的生化途徑和潛在的分子機(jī)制[11]。多元統(tǒng)計(jì)學(xué)與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)結(jié)合可以更直觀地看到植物生長(zhǎng)過程中代謝物的變化。代謝物種類及水平與農(nóng)作物的營(yíng)養(yǎng)成分具有相關(guān)性[12]。因此，利用代謝組學(xué)揭示肥料對(duì)作物代謝的影響是可行的。前人在研究小麥籽粒代謝物時(shí)，主要是通過化學(xué)方法測(cè)定糖類或氨基酸類物質(zhì)的含量，有關(guān)代謝組學(xué)方法對(duì)代謝物的組成和含量研究較少。有關(guān)減氮施用多種類型肥料對(duì)小麥籽粒代謝物影響的報(bào)道更少。鑒于上述原因，本試驗(yàn)擬從代謝組學(xué)角度研究不同類型肥料對(duì)小麥籽粒代謝物的影響，旨在探究小麥響應(yīng)肥料的代謝機(jī)理，為小麥生產(chǎn)提供施肥新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

供試小麥品種為中信麥99。試驗(yàn)于2018年10月至2019年6月在天津市武清區(qū)崔黃口鎮(zhèn)進(jìn)行。試驗(yàn)田土壤有機(jī)質(zhì)17.23 g·kg-1，pH 8.10，全氮 1.03 g·kg-1，速效磷57.35 mg·kg-1，速效鉀157.18 mg·kg-1。

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置5種不同氮肥處理，分別為常規(guī)施肥CK和4個(gè)減氮施肥處理(緩控釋肥一次性基施E，有機(jī)肥和緩控釋肥配施A，緩控釋肥與化肥配施B，專家系統(tǒng)推薦施肥NE)，具體見表1，磷肥、鉀肥均為普通化肥。每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)面積為1 hm2。小麥15 cm等行距種植，播種量為375 kg·hm-2。田間管理與當(dāng)?shù)卮筇镆恢隆?/p>

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 樣品處理

將收獲的小麥籽粒經(jīng)液氮研磨至粉末狀，取150.0 mg樣品于1 mL離心管，加入1 mL提取液(異丙醇-乙腈-水體積比1∶1∶1)，4 ℃超聲提取30 min，4 ℃ 10 000 r·min-1離心1 min，取150 μL上清液吹氮后加入10 μL鹽酸甲氧胺吡啶(40 mg·mL-1)，30 ℃水浴90 min；加入30 μL MSTFA+1%TMCS，37 ℃水浴30 min；加入1 mL含有內(nèi)標(biāo)物的正庚烷溶液(含20 μg·mL-1十一烷)，過0.22 μm濾膜，得到待 測(cè)液。

1.2.2 GC-MS條件

試驗(yàn)儀器為Aglient公司7890 A-5975 C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件：Aglient HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣(純度99.999%)，不分流進(jìn)樣。升溫程序?yàn)槌厣?0 ℃后維持1 min，以10 ℃·min-1升至280 ℃后維持5 min。質(zhì)譜條件：電子碰撞內(nèi)能70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度 150 ℃，溶劑延遲4.5 min，掃描速度2 scan·s-1，范圍50～500 m·z-1，全掃描模式。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2019計(jì)算小麥籽粒中代謝物含量，同時(shí)對(duì)保留時(shí)間(rt)及峰面積(intensity)進(jìn)行預(yù)處理；利用SIMCA-P 13.1進(jìn)行主成分分析(PCA)及偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，通過SPSS 26.0對(duì)代謝物進(jìn)行方差分析(ANOVA)，篩選差異代謝物。利用Omicshare Tools對(duì)差異代謝物進(jìn)行熱圖聚類分析。通過MetaboAnalyst平臺(tái)對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝途徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS檢測(cè)結(jié)果分析

用GC-MS檢測(cè)到小麥籽粒中共有47種代謝物，分別為有機(jī)酸12種(26%)、氨基酸10種(21%)、糖類及其衍生物14種(30%)、酯類2種(4%)和其他有機(jī)物9種(19%)。

用差異倍數(shù)(FC)表示初始值到最終值的變化程度，對(duì)差異倍數(shù)取對(duì)數(shù)表示差異的相對(duì)變化。以CK為初始值，log2FC是正數(shù)為上調(diào)，是負(fù)數(shù)為下調(diào)。由表2可見，與CK相比，其他4種處理總代謝物含量均升高，表現(xiàn)為B>NE>E>A>CK。E、B、NE處理的各類代謝物含量與總代謝物含量趨勢(shì)一致；A處理中，有機(jī)酸類和氨基酸類含量的變化與總代謝物呈相反趨勢(shì)。代謝物對(duì)肥料的敏感程度表現(xiàn)為氨基酸類>有機(jī)酸類>其他有機(jī)物>糖類及其衍生物>酯類。這說明不同施肥處理對(duì)小麥籽粒代謝物的影響具有差異性。

表1 各處理施肥情況Table 1 Fertilization of each treatment

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 PCA分析

2.2.2 PLS-DA分析

2.3 差異代謝物篩選

將PLS-DA分析獲得的變量投射重要度(variable importance for the projection，VIP)結(jié)合方差分析(one-way ANOVA)篩選差異代謝物(VIP>1且P<0.05)[14]，最終得出20種差異代謝物(表2)，分別為糖類及其衍生物(6種，30%)、有機(jī)酸(5種，25%)、氨基酸(3種，15%)、酯類(2種，10%)、其他有機(jī)物(4種，20%)。

2.4 差異代謝物熱圖分析

將20種差異代謝物進(jìn)行熱圖聚類分析，結(jié)果如圖3，圖3中每一列代表一個(gè)樣本，每一個(gè)格子代表一種代謝物，顏色深淺代表代謝物的含量高低。由圖3可見，NE和B聚在一支，CK和E聚在一支，A單獨(dú)為一支，說明篩選出的差異代謝物能將各處理聚類區(qū)分開來。差異代謝物經(jīng)過聚類也能聚成簇，說明每一簇代謝物可能參與了相同的代謝途徑或者具有相似的功能。

表2 不同施肥條件下的小麥籽粒代謝物及差異倍數(shù)Table 2 Wheat kernel metabolites and the differences under different fertilization conditions

圖1 不同施肥條件下小麥籽粒代謝物PCA得分圖Fig.1 PCA score map of wheat grain metabolites under different fertilization conditions

2.5 代謝通路富集

將篩選出的20種差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst平臺(tái)，進(jìn)行通路分析。經(jīng)分析映射出20條代謝途徑(表3)，包括代謝途徑11條，生物合成途徑7條，轉(zhuǎn)化途徑1條，降解途徑1條。其中9條與氨基酸有關(guān)，3條與糖類有關(guān)?？梢姺柿项愋蛯?duì)小麥籽粒氨基酸類及糖類的代謝和生物合成影響較大。

篩選得出3條與差異代謝物具有顯著相關(guān)的代謝途徑(P<0.05或Impact > 0.2)，分別為氨?；?tRNA的生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，異喹啉生物堿的生物合成，均與氨基酸代謝和生物合成有關(guān)。其中最明顯的為氨?；?tRNA的生物合成途徑，有三種差異代謝物富集到此途徑上，分別為色氨酸、絲氨酸和異亮氨酸，從差異代謝物熱圖分析結(jié)果(圖3)上也能看出，這三種氨基酸被聚在一簇。

圖2 不同施肥條件下小麥籽粒代謝物PLS-DA得分圖及200次模型檢驗(yàn)結(jié)果Fig.2 PLS-DA score map of wheat grain metabolites under different fertilization conditions and 200 model test results

表3 不同施肥條件下的小麥籽粒差異代謝物Table 3 Differential metabolites of wheat grains under different fertilization conditions

3 討 論

3.1 不同施肥處理對(duì)小麥籽粒代謝物的影響

氨基酸是評(píng)價(jià)小麥籽粒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一，氮肥是影響氨基酸合成的重要因素。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CK相比，B與NE處理對(duì)小麥籽粒中氨基酸含量的提升效果較優(yōu)。王宜倫等[15]發(fā)現(xiàn)，控釋氮肥可保證部分氮素在夏玉米生育后期釋放，以滿足氮素供應(yīng)，提高氮肥利用率的同時(shí)提高籽粒氮積累量，進(jìn)而促進(jìn)了籽粒氨基酸的積累。與CK相比，NE處理優(yōu)化了施氮量及施氮時(shí)期。賈良良等[16]研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)分專家系統(tǒng)推薦施肥較農(nóng)民習(xí)慣施肥，氮肥的偏生產(chǎn)力平均提高了93.3%，極大的提高了作物氮素吸收效率。

由此可見，高氮素效率是造成B、NE處理高氨基酸積累量的主要原因。A處理抑制了氨基酸的積累，但差異不明顯，這可能與肥料中化肥和有機(jī)肥的比例有關(guān)[17]。劉樹堂等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在不同施肥條件下，小麥籽粒中各氨基酸的變異系數(shù)變化較大(5.27%～13.85%)。在本試驗(yàn)中也出現(xiàn)了類似結(jié)果，與CK相比，四個(gè)處理小麥籽粒中氨基酸log2FC為-1.01～ 2.42，說明不同施肥條件對(duì)氨基酸的影響較大。

可溶性糖作為淀粉的合成底物和蛋白質(zhì)積累的碳架，具有重要的作用[19]。在本研究中，與CK相比，四個(gè)處理均提升了小麥籽粒中糖類的積累量。B處理對(duì)糖類含量的促進(jìn)效果最優(yōu)，log2FC為0.32。肖 強(qiáng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)各種控釋肥處理的小麥籽粒中可溶性糖含量均低于普通化肥，這與本試驗(yàn)結(jié)果不一的原因可能是緩控釋肥在緩釋氮素的同時(shí)也緩釋了磷、鉀素，養(yǎng)分釋放高峰期與作物需肥期不一致。而本試驗(yàn)中僅控釋了氮肥，磷、鉀肥均為普通化肥，養(yǎng)分轉(zhuǎn)化速率高，進(jìn)而提高了糖類物質(zhì)的含量。A處理效果次之，log2FC為0.22，有機(jī)肥和化肥配施能保障養(yǎng)分的供應(yīng)，有利于碳水化合物的合成，進(jìn)而促進(jìn)了糖類物質(zhì)的積累[21]。

圖3 小麥籽粒差異代謝物的熱圖聚類分析Fig.3 Heat map of differential metabolites of wheat grains

表4 代謝通路富集結(jié)果Table 4 Enrichment results of metabolic pathways

3.2 不同施肥處理對(duì)小麥籽粒代謝通路的影響

本試驗(yàn)采用代謝組學(xué)方法對(duì)小麥籽粒代謝物進(jìn)行了分析，共得出20條相關(guān)代謝通路。氨?；?tRNA的生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成和異喹啉生物堿的生物合成3條通路均與氨基酸合成有關(guān)，說明不同施肥條件對(duì)小麥籽粒中的氨基酸合成影響較大。其中，氨?；?tRNA的生物合成通路差異最為明顯，色氨酸、絲氨酸和異亮氨酸都被富集到了該通路上。色氨酸和異亮氨酸屬于必須氨基酸，是小麥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一個(gè)重要體現(xiàn)[22]。張玉寧等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在高硝態(tài)氮條件下，煙草根系中參與了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途徑的相關(guān)基因表達(dá)量上升。本試驗(yàn)在同一氮素水平下，不同的氮肥類型也明顯影響了該通路，說明氮肥的使用量和類型均是影響氨基酸生物合成的重要因素。異喹啉生物堿是一類含氮次生代謝物，其合成過程需要苯丙氨酸、色氨酸、賴氨酸和鳥氨酸的衍生物參與，可以累積在特定細(xì)胞中起到防御作用，是一種響應(yīng)不良環(huán)境的自我調(diào)節(jié)機(jī)制[24]。

綜上所述，不同施肥條件對(duì)小麥籽粒代謝物有明顯影響，B與NE處理有利于氨基酸含量的積累，B與A處理有利于糖類含量的積累。因此，在生產(chǎn)過程中，若以提高氨基酸含量為目的時(shí)，可采取緩控釋肥一次性基施或養(yǎng)分專家系統(tǒng)推薦施肥；以提高糖類含量為目的時(shí)，可采取緩控釋肥一次性基施或有機(jī)肥緩控釋化肥配施。代謝通路中氨基酸相關(guān)通路占比較大，說明通過氨基酸代謝途徑研究不同肥料對(duì)小麥籽粒代謝物的影響具有可行性，可為進(jìn)一步探究代謝機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。