HPLC法同時測定鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的含量

林霜霜, 張海峰, 車建美, 葛慈斌

(福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所， 福州 350003)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)是一種重要的香料植物，原產地為歐洲及北非地中海沿岸[1]。目前，迷迭香在貴州、云南、海南、新疆、福建、浙江等多省區(qū)廣泛種植[2-4]。迷迭香不僅可以作為觀賞植物，也是提取香料香精、食品防腐等日化、食品和醫(yī)藥工業(yè)的重要原材料[5]。研究表明，迷迭香含有非揮發(fā)性成分，如鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸等，這些多酚類物質具有較強的抗氧化性，鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸三者總和的抗氧化功效占迷迭香抗氧化功效的90%以上[6-7]，并在抗菌、消炎、抗腫瘤、抗過敏、護肝等方面都有不同程度的生物學活性，是近年來醫(yī)療保健開發(fā)應用的熱點之一[8]。

目前，有關迷迭香活性成分的研究主要側重于對鼠尾草酸、鼠尾草酚或迷迭香酸3種活性成分含量的檢測[2-4，9]，主要檢測方法包括紫外分光光度法、氣相色譜、高效液相色譜(HPLC)-質譜聯用等方法[10-12]。迷迭香植株中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸含量的測定常采用HPLC法進行。通過HPLC法檢測鼠尾草酸和鼠尾草酚的含量，可以用于核對迷迭香最佳采收期[4,9]，為迷迭香及其提取物的質量控制提供依據[2-3]，還能用于篩選適宜迷迭香愈傷組織成長的LED光質[13]。由于HPLC方法具有快速、準確等優(yōu)點，所以篩選適宜的HPLC條件對于研究迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸等成分含量以鑒定不同品種的差異具有重要作用。迄今為止，采用HPLC法同時測定迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸3種活性成分的檢測方法尚未見相關報道。鑒于此，本研究基于HPLC平臺建立同時檢測迷迭香3種活性成分的方法，旨在為今后迷迭香非揮發(fā)性成分的開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4個迷迭香品種為針葉迷迭香(Rosmarinusofficinalis"Pine")、小葉迷迭香(RosmarinusofficinalisL)、大葉迷迭香(Rosmarinusofficinalis"Rex")和賽汶海迷迭香(Rosmarinusofficinalis"Severn Sea")，均在2017年6月份采集于福建省農業(yè)科學院亞熱帶農業(yè)研究所芳香植物資源圃。迷迭香的葉和莖提取精油后瀝干水分，60 ℃烘干6 h至恒重，分別粉碎過80目篩后，低溫(-4 ℃)保存。

1.2 儀器與藥品

高效液相色譜：Agilent 1290，美國安捷倫科技公司；高速臺式離心機：TGL-10B，上海安亭科學儀器廠(上海飛鴿離心機)；全自動樣品氮吹濃縮儀：TurbovapⅡ，美國Biotage公司；C18固相萃取小柱：SPE C18，賽分科技有限公司(Sepax Technologies, Inc)；液相色譜柱：SB-C18，賽分科技有限公司(Sepax Technologies, Inc)。

乙腈為Fisher Chemical公司的色譜純；無水乙醇為上海國藥集團化學試劑有限公司的分析純。鼠尾草酸：ASOYA-U，東京化成工業(yè)株式會社，純度97.0%；鼠尾草酚：ZZS17061906，上海甄準生物科技有限公司，純度≥97%；迷迭香酸：ZZS17061907，上海甄準生物科技有限公司，純度≥98%。

1.3 色譜條件優(yōu)化

色譜條件參考劉永錄等[9]的方法進一步改進。流動相為乙腈(A)+水(B)，梯度洗脫程序為：A：B (60%：40%)，0—10 min；A：B (100%：0%)，20—30 min，其中10—20 min溶劑比例是按照線性變化的。

色譜條件優(yōu)化：對鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸標準溶液在200～450 nm進行全波段紫外吸收掃描。確定最大吸收波長，并選擇最優(yōu)檢測波長。流速：0.8 mL·min-1。柱溫：35 ℃。色譜柱：C18，250 mm×4.6 mm，5 μm。進樣量：10 μL。

1.4 迷迭香樣品測定

準確稱取迷迭香樣品1.0 g置于50 mL帶蓋試劑瓶，用10 mL無水乙醇超聲波提取30 min后，2 500 r·min-1離心2 min，上清液氮吹至近干再用5 mL乙腈溶解，4℃ 4 000 r·min-1離心2 min，進一步純化上清液。

純化步驟：用適量乙腈活化C18小柱，將上述上清液過C18小柱，收集流出液；再用10 mL乙腈淋洗C18小柱，收集流出液。合并兩次流出液，氮吹至近干后，用乙腈溶解并定容至25 mL，上機前過膜(尼龍濾膜，0.45 μm)，然后進樣測定。

1.5 對照品溶液的制備

分別準確稱取鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸標準物質20 mg，用適量無水乙醇超聲溶解后用無水乙醇定容至20 mL，配制成1 000 mg·L-1的標準儲備溶液，避光置于4℃冰箱保存。準確移取適量標準儲備溶液，用無水乙醇稀釋配制成一系列標準溶液：鼠尾草酸標準工作溶液7、14、28、56、112 mg·L-1；鼠尾草酚標準工作溶液2.5、5、10、20、40 mg·L-1；迷迭香酸標準工作溶液3、6、12、24、48 mg·L-1。標準工作溶液將用于標準曲線的繪制與回收率的測定。

1.6 方法性能驗證

精密度測定：按照1.1步驟制備好迷迭香樣品，按1.4所述步驟測定試樣中鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸含量，平行測定6次，計算相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。

穩(wěn)定性測定：按照1.1步驟制備好迷迭香樣品，將其置于室溫中(25 ℃)。每間隔4 h取樣,按1.4所述步驟測定試樣中鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸含量。

回收率測定：測定添加標準工作溶液后試樣中的鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸含量，計算回收率。

式中，w為回收率；Cp為加標樣品實際測試值；Ct為加標樣品理論值。

1.7 數據分析

采用Origin Pro8.0進行繪圖，SPSS 20.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由圖1可知，迷迭香酸的最大吸收峰為330 nm，鼠尾草酚在205、280 nm處有吸收，鼠尾草酸在205、230、280 nm處有吸收。鼠尾草酸在205 nm處信號基線不穩(wěn)定，且雜質物質較多，容易對目標物造成干擾；在280 nm處的摩爾吸光系數較小，響應值低，不靈敏；因此，選擇230 nm作為鼠尾草酸檢測波長。最終確定迷迭香酸檢測波長為330 nm，鼠尾草酚檢測波長為280 nm，鼠尾草酸檢測波長為230 nm。通過實際樣添加標準品試驗，上述3種物質響應值良好，色譜峰型尖銳，且與基體物質分離完全，能夠準確定性定量檢測。圖1結果還顯示，鼠尾草酸的出峰位置在13.17 min，鼠尾草酚的出峰位置在7.453 min，迷迭香酸的出峰位置在1.732 min。峰形良好，靈敏性高，重現性好。樣品中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的峰形及與其他雜峰分離度最為理想。

圖1 迷迭香酸、鼠尾草酚、鼠尾草酸的紫外吸收譜及其與迷迭香樣品的對比

2.2 線性回歸方程與相關系數

從圖2可以看出，按色譜條件測定峰面積，以進樣濃度(mg·L-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，進行回歸計算得線性回歸方程為鼠尾草酸：y=16.001x+12.373，R2=0.999 6；鼠尾草酚：y=3.867 2x-0.606 7，R2=0.999 9；迷迭香酸：y=24.28x+0.352 1，R2=0.999 6。

圖2 鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸標準曲線

2.3 精密度試驗結果

表1結果顯示，3種物質的RSD分別為1.44%、1.44%和2.76%，均低于5%，表明本研究建立的方法精密度良好。

表1 鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的精密度試驗結果

2.4 穩(wěn)定性試驗結果

表2結果顯示，3種物質的RSD分別為1.45%、4.57%和0.96%，均低于5%，含量無明顯差別，說明迷迭香樣品在室溫條件下放置20 h內穩(wěn)定。

表2 鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的穩(wěn)定性試驗結果

2.5 回收率試驗結果

回收率試驗結果見表3。從表3可知，3種物質的回收率均達到85%以上，表明本研究建立的方法準確可靠。

表3 鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的回收率試驗結果

2.6 不同品種迷迭香樣品測定結果

圖3結果顯示，4個品種迷迭香葉片和莖中的鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的含量差異顯著(P<0.05)，不同品種迷迭香葉片中的鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的含量明顯高于莖中的含量。

注：同一活性成分不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

4個品種迷迭香葉片中鼠尾草酸含量均大于鼠尾草酚和迷迭香酸。針葉迷迭香葉片中鼠尾草酸(25 585.00 mg·kg-1，σ=178.40)和鼠尾草酚含量(11 823.00 mg·kg-1，σ=4)明顯高于其他品種。針葉迷迭香葉片中鼠尾草酸含量比賽汶海迷迭香高31.87%，比大葉迷迭香含量高75.44%；針葉迷迭香葉片中鼠尾草酚的含量比小葉迷迭香(10 464.00 mg·kg-1，σ=103)和大葉迷迭香(10 497.00 mg·kg-1，σ=174)葉片中鼠尾草酚含量高12.99%、12.64%，比賽汶海迷迭香(4 130.00 mg·kg-1，σ=19)高186.26%。大葉迷迭香葉片中迷迭香酸含量最高(7 572.67 mg·kg-1，σ=45.09)，鼠尾草酸含量(14 583.00 mg·kg-1，σ=46.09)最低。

小葉迷迭香莖中鼠尾草酸含量(1 570.00 mg·kg-1，σ=13.07)、鼠尾草酚含量(1 603.00 mg·kg-1，σ=39)和迷迭香酸含量(1 304.67 mg·kg-1，σ=56.95)都高于其余3個品種。大葉迷迭香莖中鼠尾草酸含量(710.00 mg·kg-1，σ=26.25)最低，比小葉迷迭香低121.18 %。賽汶海迷迭香莖中的鼠尾草酚(709.00 mg·kg-1，σ=42)和迷迭香酸(774.33 mg·kg-1，σ=26.85)含量最低，與各品種迷迭香莖中的鼠尾草酚和迷迭香酸含量呈顯著差異(P<0.05)。

3 討論

3.1 流動相與梯度程序的選擇

目前常規(guī)洗脫方式為等度洗脫[2,4,14]，但由于其檢測對象僅1～2種，等度洗脫可以滿足分離需要。本研究首次使用高效液相色譜同時測定迷迭香中3種抗氧化成分(鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸)，而等度洗脫無法完全分離被測物，因此采用了梯度洗脫的方式。

3.2 流動相體系及比例的選擇

由于迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚3種物質都具有較好的水溶性[15]，因此篩選甲醇-水或乙腈-水體系作為流動相。由于植物提取液中天然產物眾多，在洗脫能力強的體系中各種物質出峰時間集中，目標物質易被干擾，導致定量不準或是產生假陽性。迷迭香酸的出峰位置靠前，如果采用甲醇-水體系，甲醇溶劑峰位置與迷迭香酸出峰位置接近，造成其峰形不對稱。因此參考前人研究結果[4,9,16]，采用洗脫能力較弱的乙腈-水體系作為流動相，說明迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚三者同時測定適宜采用乙腈-水體系。

為保證提取液中各物質得到有效分離，同時盡量縮短分析時間，對初始階段乙腈不同比例(40%、50%、60%、70%)對分離效果的影響進行試驗。結果表明，初始乙腈比例為70%時，迷迭香酸出峰時間過短(<1 min)；初始乙腈比例為40%、50%、60%時，迷迭香酸出峰時間延后(2～3 min)。為縮短分析時間，應選擇乙腈的初始比例為60%，并保持10 min，迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚在10 min內均能出峰，分離良好，且峰形尖銳對稱。10 min后將乙腈比例升至100%，并保持10 min，可使其他物質全部流出，避免對下次進樣的干擾。本研究所采用的乙腈比例與前人研究結果[4,9,14]一致，說明迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚同時測定時，適宜采用比例為60：40的乙腈與水體系。

3.3 色譜柱的選擇

本研究通過采用C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)和C8柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)對3種物質的分離比較發(fā)現，C18柱的分離效果更好，3種物質的峰形對稱、尖銳；C8柱對鼠尾草酸和鼠尾草酚的保留能力較弱，保留時間接近，容易互相干擾。因此，試驗中選擇C18柱對3種物質進行分離檢測，C18柱是目前分離迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚這3種物質的主流色譜柱[4,9,16-17]。

3.4 固相萃取凈化條件的優(yōu)化

迷迭香成分復雜，可分為脂溶性和水溶性兩大類。由于本研究樣品已初步提取精油，因此所含揮發(fā)性成分和水溶性成分較少，經過乙醇提取后的物質以脂溶性居多。去除脂溶性物質，應選用C18固相萃取柱對迷迭香提取液進行凈化。由于乙醇沸點較高，不利于后續(xù)濃縮步驟，且對一些無機鹽類有一定溶解性。而乙腈對3種物質的溶解性較好，且具有易揮發(fā)、對無機鹽溶解性差的特點。因此，將乙醇提取液旋蒸至近干，采用乙腈進行溶劑置換和固相萃取凈化步驟。

固相萃取凈化全過程均采用乙腈作為溶劑，通過研究洗脫溶劑用量對目標物回收率的影響，結果發(fā)現，鼠尾草酸出峰時間最晚，因此，以鼠尾草酸為標記物來考察洗脫溶劑用量(5、10和15 mL)對目標物回收率的影響。試驗結果表明，一定條件下,洗脫液體積越大，目標物的回收率越高，但同時許多雜質也得不到很好的吸附凈化，因此確定本研究選擇洗脫液體積為10 mL。目前尚未有文獻研究迷迭香固相萃取凈化條件的優(yōu)化，對迷迭香提取物的凈化是本研究的創(chuàng)新之處。

3.5 迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸的含量差異

通過研究鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸在迷迭香植物里的積累規(guī)律可以確定迷迭香的采收日期。李雷鴻等[4]和劉永錄等[9]通過研究不同采收期迷迭香中鼠尾草酸和鼠尾草酚含量，分別確定了秋季10月為迷迭香的最佳采收期，其次為6—7月份。

但由于產地不同、品種差異，迷迭香中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸含量也都不盡相同，本研究6月在漳州采收定植3年以上的4個品種迷迭香，并對其鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸含量進行測定。結果顯示，針葉迷迭香葉片中鼠尾草酸和鼠尾草酚含量明顯高于其他品種，大葉迷迭香葉片中迷迭香酸含量最高，小葉迷迭香莖中鼠尾草酸、鼠尾草酚和迷迭香酸含量都高于其余3個品種。本研究中6月份采收的針葉迷迭香鼠尾草酸含量高于10月份采收的浙江富陽藥用植物種植基地迷迭香中的鼠尾草酸含量[4]，低于6月份采收的河南禹州市森源本草天然產物有限公司藥用植物GAP生產基地種植的迷迭香中鼠尾草酸含量[9]，6月份采收的針葉迷迭香鼠尾草酚含量高于同月份采收的河南禹州產迷迭香[9]。因此，含量差異可能與種植水平、產地、品種和定植時間有關。