染色體微陣列分析對(duì)智力障礙/發(fā)育遲緩患兒病因檢測的應(yīng)用

湯鎮(zhèn)川 童光磊 李 紅 周陶成 徐艷紅

智力障礙（ID）/發(fā)育遲緩（DD）是兒童康復(fù)學(xué)科臨床診治中最為多見的疾病之一，嚴(yán)重影響兒童的身心健康。全球人口中發(fā)病率約占3%，而中國的發(fā)病率約為0.9%，其中年齡在6歲以下的就有95.4萬人[1]。其特征表現(xiàn)為在18歲之前，智力能力落后同階段的兒童且在兩項(xiàng)或多項(xiàng)適應(yīng)性技能方面（例如自我護(hù)理，溝通技能，解決問題和邏輯思維）存在極大限制[2]。國內(nèi)大多數(shù)ID/DD兒童因?yàn)椴∫虿幻鞫诱`了最佳康復(fù)治療時(shí)期。染色體微陣列分析（CMA)是目前國際公認(rèn)用于不明原因ID/DD兒童的一線診斷方法，有別于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)診斷方法[3]。它能為ID/DD遺傳病因?qū)W上的精準(zhǔn)診斷提供更高的分辨率，檢測到基因拷貝數(shù)異常（CNV），從而發(fā)現(xiàn)各種CNV導(dǎo)致的微缺失或微重復(fù)綜合征，給病因診斷帶來新的進(jìn)展。本研究收集了149例不明原因ID/DD患兒，利用CMA技術(shù)進(jìn)行遺傳病因?qū)W檢測，旨在進(jìn)一步為臨床上診斷ID/DD患兒病因提供科學(xué)可靠的理論依據(jù)，更好地進(jìn)行早期針對(duì)性綜合康復(fù)治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年6月-2019年12月于本醫(yī)院就診的不明原因ID/DD患兒共149例，男性80例，女性69例。本研究方案經(jīng)安徽省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，患兒或其家長簽署知情同意書。診斷標(biāo)準(zhǔn)：按照不同年齡段采取不同的測試方法：Gesell發(fā)育量表適用于0～4歲兒童，中國-韋氏幼兒智力量表（C-WYCSI）適用于4～6歲，中國韋氏學(xué)齡兒童智力量表（C-WISC）適用于6歲以上兒童。同時(shí)所有患兒日常生活活動(dòng)能力（ADL）則通過嬰兒-初中學(xué)生社會(huì)生活能力量表進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)DQ或IQ低于70，伴ADL低下，對(duì)年齡大于5歲的患兒診斷為ID，對(duì)年齡小于5歲稱為DD。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) ①納入標(biāo)準(zhǔn)：符合ID/DD診斷。獲得患兒或家長知情同意。②排除標(biāo)準(zhǔn)：通過染色體核型分析及遺傳代謝性血、尿篩查可明確的病因；明確的顱腦外傷，生后患有中樞系統(tǒng)感染性疾??；未同意基因檢測或相關(guān)臨床信息不完善者。

1.3 方法 收集患兒的相關(guān)臨床病史并進(jìn)行CMA檢測：用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集患兒靜脈血2 mL，嚴(yán)格采用Affymetrix公司配套檢測試劑盒及優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，使用CytoScan 750K芯片進(jìn)行全基因組范圍掃描，包括DNA提取、酶切、連接、PCR，PCR產(chǎn)物純化、片段化、標(biāo)記、雜交、掃描和結(jié)果分析等步驟。CytoScanR 750K芯片的探針是從CytoScanR HD芯片上精選出來的75萬多個(gè)探針，由55萬個(gè)CNV探針和20萬個(gè)基因分型精確度高達(dá)99%的SNP探針組成，以平均大約1個(gè)探針標(biāo)記/4 kb的密度分布于人類的整個(gè)基因組。隨后通過Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software軟件分析數(shù)據(jù)，根據(jù)檢測到的CNV與DGV、ClinGen、DECIPHER、lSCA、OMlM等公共數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)比來明確CNV類型。美國遺傳學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）將CMA檢測出的CNV分為五大類：致病性CNV，可能致病性CNV，可能良性CNV和良性CNV，臨床意義不明確CNV[4]。

2 結(jié) 果

2.1 36 例致病性CNV患兒的CMA檢測結(jié)果分析 CMA在149例不明原因ID/DD患兒中檢測出致病性CNV共36例，占24.2%（36/149），片段大小范圍在0.15Mb到15.4Mb之間。其中包括28例微缺失和8例微重復(fù)，現(xiàn)數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)報(bào)道過的已知綜合征有26例：而數(shù)據(jù)庫中暫未定義的綜合征的致病性CNV有11例。見表1。

表1 36例致病性CNV患兒CMA檢測結(jié)果

2.2 36 例致病性CNV患兒臨床癥狀分析 在36例致病性CNV患兒中，男性19例，女性17例，伴先天發(fā)育畸形和特殊面容的有13例，占36.1%（13/36），伴孤獨(dú)癥譜系障礙（ASD）有4例，占11.1%(4/36)神經(jīng)影像檢查提示異常19例，占52.7%(19/36)，腦電圖檢查提示異常4例，占11.1%（4/36）。見表2。

表2 36例致病性CNV患兒臨床癥狀

3 討 論

ID/DD的病因復(fù)雜多樣，通常是由于遺傳和環(huán)境因素的相互作用引起的，而在明顯存在認(rèn)知障礙的兒童中遺傳因素則更為突出[5]。Rauch A等[6]通過對(duì)670名智力障礙患兒病因探討，發(fā)現(xiàn)39.5%的ID/DD與遺傳原因有關(guān)，而1.3%是由于后天因素或環(huán)境因素造成的，還有50%～60%的人群未能明確病因。因此CMA的引入為ID/DD發(fā)病機(jī)制中的亞端粒重組突變的發(fā)現(xiàn)帶來重大發(fā)展，并且突破傳統(tǒng)檢測技術(shù)在分辨率，基因組特異性和檢測周期上的限制。

本研究利用CMA技術(shù)在149例ID/DD患兒中檢測出36例致病性CNV患兒，陽性率為24.2%，與國內(nèi)胡珺潔等[7]報(bào)道的22.1%，王榮躍等[8]報(bào)道的25.8%基本一致。而陽性率的高低起伏可能與樣本量大小，檢測技術(shù)平臺(tái)不同，數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不斷更新有關(guān)。例如在此次研究中有48例患兒為臨床意義不明確CNV，對(duì)于這些兒童，必須由臨床醫(yī)生進(jìn)行定期隨訪和重新評(píng)估，因?yàn)殡S著文獻(xiàn)中豐富了更多臨床和基因組數(shù)據(jù)，這些臨床意義不明確CNV最終可能會(huì)被重新分類為致病性或良性的，隨之相應(yīng)的陽性率也會(huì)有所波動(dòng)。

Williams–Beuren綜合征其主要臨床特征除了智力障礙、特殊面容以外，還表現(xiàn)為身材發(fā)育遲緩，內(nèi)分泌紊亂（高鈣血癥），約80%的患者伴心血管畸形，如主動(dòng)脈瓣上狹窄、肺動(dòng)脈狹窄[9]。然而僅有病例10、11接近其臨床表型，病例10的患兒還存在視神經(jīng)發(fā)育障礙，可能與該綜合征的GTF2IRD基因調(diào)控的視神經(jīng)表達(dá)相關(guān)。病例8、9患兒特殊面容不明顯，心臟彩超檢查也未見明顯異常，僅實(shí)驗(yàn)室檢查提示血鈣偏高。因15q11.2q13.1缺失導(dǎo)致的Angelman/Prader-Willi綜合征檢出5例，5例均患有輕到中度的智力障礙，臨床表現(xiàn)及體征與綜合征所報(bào)道的大致相仿[10]，特別是病例19為1歲11月的女孩，臨床表現(xiàn)為精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯，嚴(yán)重語言落后，癲癇，喜笑，與文獻(xiàn)報(bào)道的天使綜合征高度一致，該疾病是由于母源或父源遺傳印記缺陷所致，人群中發(fā)病率約為1/15000[11]。

朱伯特綜合征（Joubert syndrome）是罕見的一類源于感覺細(xì)胞器(原發(fā)性纖毛)的缺陷的疾病。該綜合征涉及多個(gè)器官系統(tǒng)的疾病，包括大腦，眼睛和腎臟。常見癥狀包括呼吸異常，智力發(fā)育遲緩，肌張力異常和異常的眼球運(yùn)動(dòng)，神經(jīng)影像學(xué)檢查常有提示典型的“臼齒征[12]。朱伯特綜合征涉及35個(gè)致病基因，不同基因調(diào)控著不同編碼產(chǎn)物導(dǎo)致臨床類型不盡相同[13]。病例1是一位3歲女孩，因智力發(fā)育遲緩就診，有特殊面容，雙眼瞼下垂，右側(cè)明顯，右眼內(nèi)斜視，雙下肢肌張力異常，頭顱磁共振檢查提示“臼齒征”?；純航?jīng)CMA檢查后顯示2號(hào)染色體長臂2q13區(qū)域缺失，缺失片段長度為0.48Mb，包含一個(gè)OMIM基因NPHP1。其中NPHP1 突變可導(dǎo)致雙眼視力退化，行走不能，運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩等。該患兒除了常規(guī)的康復(fù)治療外，在病因?qū)W上的明確后，未來的動(dòng)物模型和靶向基因療法的開發(fā)將有助于為患有這種挑戰(zhàn)性疾病的患者提供個(gè)性化治療。

FOXG1基因被認(rèn)為與嚴(yán)重的Rett樣表型有關(guān)。它點(diǎn)突變編碼是對(duì)前腦發(fā)育至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄阻遏物。先天性rett綜合征屬于經(jīng)典rett綜合征的變異，臨床表現(xiàn)多為智力低下，嚴(yán)重的言語發(fā)育障礙、癲癇等。病例2，女，3歲，表現(xiàn)為雙眼可見水平震顫，言語認(rèn)知能力低下，CMA提示先天性Rett綜合征，繼而完善B超檢查提示左側(cè)卵巢未探及。Rett變異型較為罕見，此次發(fā)現(xiàn)在一定程度上豐富了rett綜合征和FOXG1基因突變的表型基因數(shù)據(jù)庫，為進(jìn)一步康復(fù)診治個(gè)體化制定提供相關(guān)理論支撐。

Kleefstra綜合征又稱9q34.3微缺失綜合征，是位于同一基因組區(qū)域的EHMT1基因突變導(dǎo)致的罕見遺傳病。病例14、15為親姐妹，智力水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后同齡兒童，均有特殊面容，通過完善CMA檢測，診斷為Kleefstra綜合征。2例罕見綜合征的發(fā)現(xiàn)更加完善相關(guān)數(shù)據(jù)庫信息及臨床表征內(nèi)容，為臨床醫(yī)生在診治ID/DD患兒提供更多的遺傳病因?qū)W資料，所以對(duì)CNV進(jìn)行包括詳細(xì)臨床表型評(píng)估在內(nèi)的進(jìn)一步研究是相當(dāng)有必要。

據(jù)報(bào)道，人類基因組中隨機(jī)重復(fù)頻率可能低于缺失的頻率[14]。本研究檢測到全部CNV重復(fù)與缺失比例接近1:1，而致病性CNV患兒中微缺失和微重復(fù)比例為3.5:1，這表明人類基因組重復(fù)的耐受性優(yōu)于缺失。換言之，使用CMA鑒定的CNV缺失比重復(fù)更可能是致病的。由于表型與基因型對(duì)應(yīng)復(fù)雜多變，難以從表型推斷出致病基因組區(qū)域，所以針對(duì)基因組失衡的靶向檢測，全基因組CMA優(yōu)于熒光原位雜交技術(shù)（FISH）。無論ID/DD患兒臨床表現(xiàn)如何，是否有特殊面容和畸形，都應(yīng)對(duì)不明原因的ID/DD患兒進(jìn)行CMA檢測。事實(shí)上，CMA也存在不少局限性，染色體平衡易位，倒位，點(diǎn)突變等方面就是CMA診斷的盲區(qū)。下一代測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）等新興技術(shù)可能會(huì)在將來克服CMA的這些局限性，但現(xiàn)今仍有一些問題需要解決，例如測序數(shù)據(jù)分析復(fù)雜，檢驗(yàn)成本高等。因此，CMA仍是現(xiàn)今應(yīng)用于ID/DD患兒遺傳學(xué)病因檢測的一線診斷方法。

研究表明CMA作為具有高通量、高分辨的一線分子遺傳學(xué)的診斷技術(shù)，為我們深入認(rèn)識(shí)到ID基因異常形成的機(jī)制和產(chǎn)前咨詢提供了技術(shù)支持，也為我們能夠?qū)ふ襂D/遺傳學(xué)診斷及相關(guān)治療方式指引方向。在ID/DD患兒的遺傳學(xué)診斷中非常具有臨床實(shí)用性。對(duì)于所有ID/DD的兒童，應(yīng)將CMA檢測作為第一臨床診斷測試。