不同方法提取的鷓鴣茶多酚抗氧化及抑菌性比較

段宙位　李鵬　何艾　王世萍　謝輝

摘 ?要：為篩選適合鷓鴣茶多酚的提取方法，在熱水浸提法、有機溶劑浸提法和纖維素酶輔助浸提法提取鷓鴣茶多酚基礎(chǔ)上，采用DPPH自由基法、ABTS自由基法、羥自由基法、超氧陰離子法和還原力法評價多酚提取物的抗氧化性;濾紙片擴散法和二倍稀釋法測定多酚提取物的抑菌性。結(jié)果表明，熱水浸提法、有機溶劑浸提法和纖維素酶輔助浸提法提取鷓鴣茶多酚的得率分別為（10.31±0.42）%、（9.79±0.38）%、（10.88±0.52）%;含量分別為（44.72±2.26）%、（39.54± 1.78）%、（47.07±2.52）%。3種方法浸提的多酚提取物均具有較強的抗氧化性，纖維素酶輔助提取的鷓鴣茶多酚（CFC）清除DPPH自由基能力最強，其半抑制濃度（IC50）為（0.0034±0.0002）mg/mL;熱水浸提的鷓鴣茶多酚（WFC）清除ABTS自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基能力最強，其IC50值分別為（0.066±0.004）、（0.069±0.004）、（0.127± 0.009）mg/mL。3種方法浸提的多酚提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌均有較好抑制作用，其中WFC對4種細菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑依次為（12.34±1.01）、（12.16±0.95）、（2.12±0.15）、（6.12±0.36）mm，最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）依次為3.13、3.13、12.50、6.25 mg/mL。綜合考慮，鷓鴣茶多酚提取采用熱水浸提法較為適宜。

關(guān)鍵詞：鷓鴣茶;多酚;提取;抗氧化活性;抑菌性

中圖分類號：S326 ? ? ?文獻標識碼：A

Antioxidant and Bacteriostasis Activity of Flavanoid from Mallotus oblongifolius by Different Extraction Methods

DUAN Zhouwei1，2， LI Peng3， HE Ai1， WANG Shiping1， XIE Hui1*

1. Institute of Processing & Design of Agroproducts， Hainan Academy of Agricultural Science， Haikou， Hainan; 571100， China; 2. Collage of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070， China; 3. College of Animal Science and Technology， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： The aim was to select the suitable method for extracting the polyphenols from Mallotus oblongifolius. The polyphenols were extracted by hot water extraction， organic solvent extraction and cellulase-assisted extraction. The antioxidant activity of the extract density was evaluated by scavenging DPPH， ABTS， hydroxyl， superoxide anion radical and reducing force methods. The antibacterial activity of the polyphenol extracts was determined by filter paper diffusion method and double dilution methods. The yield of polyphenols by the hot water extraction method， organic solvent extraction method and cellulase-assisted extraction method was （10.31±0.42）%， （9.79±0.38）%， and （10.88± 0.52）%， respectively， and the content was （44.72±2.26）%， （39.54±1.78）%， and （47.07±2.52）%. The polyphenol extracts extracted by the three methods had strong antioxidant properties. The cellulose-assisted extraction of the polyphenols from M. oblongifolius （CFC） had the strongest ability to scavenge DPPH radical， and its half inhibitory concentration （IC50） was （0.0034±0.0002） mg/mL. The hot water-extracted polyphenols from M. oblongifolius （WFC） had the strongest ability to scavenge ABTS radical， hydroxyl radical， and superoxide anion radical， and the IC50 values was （0.066±0.004）， （0.069±0.004）， （0.127±0.009） mg/mL. The polyphenol extracts extracted by the three methods had a good inhibitory effect on four bacteria. Among them， WFC had a good inhibitory effect on Escherichia coli， Staphylococcus aureus， Bacillus subtilis and Pseudomonas aerugino， the inhibitory zone diameter was （12.34±1.01）， （12.16±0.95）， （2.12±0.15）， （6.12±0.36）mm， and the minimum inhibitory concentration （MIC） was 3.13， 3.13， 12.50， 6.25 mg/mL. Comprehensive consideration， the hot water extraction method is more suitable for the extraction of polyphenols from M. oblongifolius.

Keywords： Mallotus oblongifolius; flavonoids; extraction; antioxidant activity; antibacterial

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.033

鷓鴣茶[Mallotus oblongifolius（Miq.）Muell- Arg]系大戟科（Euphorbiaceae）、野桐屬（Mallotus）植物的干燥葉，又稱山苦茶，主要分布在中印半島、蘇門答臘島[1-2]以及我國海南島等地區(qū)，是海南一種具有濃郁地方特色的代茶飲料植物和藥用植物。鷓鴣茶中含有多酚、多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、苷類及萜類等多種營養(yǎng)物質(zhì)[3-5]，具有鎮(zhèn)痛、解油膩、助消化、抗氧化、抗衰老、利膽消炎、調(diào)節(jié)免疫等功效[6-8]。

近年來，隨著區(qū)域特色農(nóng)產(chǎn)品發(fā)展，鷓鴣茶的研究逐漸增多，主要集中在化學(xué)成分分析、活性測定及飲料開發(fā)上，如林連波等[9]研究了海南山苦茶揮發(fā)油成分;李彥軍等[10]測定了鷓鴣茶提取物的抑菌活性;瞿兆蕙等[11]利用鷓鴣茶制作低能量涼茶飲料。多酚是具有多個酚羥基的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抑菌、抗癌與抗動脈硬化等多種功效[12-16]。多酚常用的提取方法有熱水浸提法[17]、有機溶劑浸提法[18]、酶輔助提取法[19]、超聲波輔助提取法[20]等，不同方法提取的多酚含量、種類和活性不一樣。比較不同提取方法，篩選出適合鷓鴣茶多酚的提取方法，這對充分利用鷓鴣茶資源，提高其應(yīng)用價值具有非常重要的意義。因此，本研究以鷓鴣茶為原料，在優(yōu)化熱水浸提、有機溶劑浸提和酶輔助提取鷓鴣茶多酚工藝基礎(chǔ)上，測定提取物的抗氧化性、抑菌性，以期確定最佳的提取方法，為鷓鴣茶進一步研究利用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?鷓鴣茶干粉：將2019年8月9日采摘于海南省文昌市銅鼓嶺鷓鴣茶鮮葉（7～8成熟），洗凈后50 ℃烘干，粉碎、過40目篩，制得鷓鴣茶干粉。

2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，純度≥98%），上海生工生物有限公司;過硫酸鉀、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、三氯乙酸、H2O2、氯化鐵均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，純度≥99%），Sigma公司;沒食子酸（純度≥98%），北京索萊寶科技有限公司;枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、綠膿桿菌（Pseudomonas aerugino）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備 ?CPA225D型電子天平，德國Sartorius公司;1800型可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司;HZQ-211型恒溫振蕩器，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;YHSP-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，常州市天竟實驗儀器廠。

1.2 ?方法

1.2.1 ?鷓鴣茶多酚的提取 ?（1）熱水浸提法提取鷓鴣茶多酚。將鷓鴣茶干粉在溫度80 ℃，料液比1∶20（g/mL）條件下，浸提2.0 h，過濾，得到鷓鴣茶提取液;55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥，得到鷓鴣茶多酚提取物（以下簡稱WFC）。

（2）有機溶劑浸提法提取鷓鴣茶多酚。將鷓鴣茶干粉用50%乙醇（V/V），在溫度55 ℃，料液比1∶15（g/mL）條件下，浸提2.0 h，過濾，得到鷓鴣茶提取液;55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥，得到鷓鴣茶多酚提取物（以下簡稱OFC）。

（3）纖維素酶輔助有機溶劑提取鷓鴣茶多酚。將鷓鴣茶干粉在乙醇濃度50%（V/V）、溫度55 ℃、pH 5.5、底物質(zhì)量濃度40 g/L、纖維素酶添加量150 U/g條件下浸提2.0 h，過濾，得到鷓鴣茶提取液;55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥，得到鷓鴣茶多酚提取物（以下簡稱CFC）。

1.2.2 ?鷓鴣茶多酚質(zhì)量濃度的測定 ?參考段宙位等[18]方法，略有改動。將鷓鴣茶提取液稀釋500倍，往1 mL稀釋液中加入1 mL Folin-Ciocalteu和2 mL 15% Na2CO3溶液，混勻反應(yīng)1 h后，于765 nm處測定吸光值。配制不同質(zhì)量濃度沒食子酸溶液，按上述方法測定吸光值，繪制標準曲線，y =34.286x+0.0332，R2=0.9967。根據(jù)標準曲線計算多酚質(zhì)量濃度。

1.2.3 ?鷓鴣茶多酚得率與含量的測定 ?按照下列公式計算多酚得率與含量。

多酚質(zhì)量（g）=（A₇₆₅?0.0332）×500×V/（34.286 ×1000）

式中：A₇₆₅為樣液吸光值;500為樣液稀釋倍數(shù);V為樣液體積。

得率=m₁/m₀×100%

式中：m₁為多酚質(zhì)量（g）;m₀為鷓鴣茶原料質(zhì)量（g）。

含量= m₁/m₂×100%

式中：m₁為多酚質(zhì)量（g）;m₂為鷓鴣茶多酚提取物質(zhì)量（g）。

1.2.4 ?鷓鴣茶多酚提取物的抗氧化性測定 ?以蒸餾水為溶劑，將3種方法提取的鷓鴣茶多酚提取物配成不同質(zhì)量濃度樣品液，參考Cai等[21]方法測定DPPH自由基清除作用，Dinh等[22]方法測定ABTS自由基清除作用，朱淑云等[23]方法測定羥自由基清除作用，李花等[24]方法測定超氧陰離子自由基清除作用，段宙位等[18]方法測定還原力。

1.2.5 ?鷓鴣茶多酚提取物對細菌抑菌作用 ?采用濾紙片擴散法[25]，測量抑菌圈直徑。制備濃度為106～108 CFU/mL菌液，取0.10 mL菌液，均勻涂布于LB培養(yǎng)基。將滅菌的直徑6 mm圓形濾紙片于各多酚提取液中浸泡30 s后取出，置于培養(yǎng)基上。以無菌水作對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.6 ?鷓鴣茶多酚提取物的最小抑制濃度測定 ?采用二倍稀釋法[26]，測定鷓鴣茶多酚提取物抑制菌株的最小抑制濃度（MIC）值。將不同質(zhì)量濃度的鷓鴣茶多酚提取液添加到LB培養(yǎng)基中，搖勻，配成鷓鴣茶多酚提取物終濃度為50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/mL的培養(yǎng)基。取0.20 mL濃度為106～107 CFU/mL菌液，于培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。以不含鷓鴣茶多酚提取液的LB培養(yǎng)基為空白對照，以無細菌生長的樣液最低濃度為MIC。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同方法提取的鷓鴣茶多酚得率與含量

同一原料，不同提取工藝，提取物得率和含量不一樣。由表1可知，CFC中多酚得率和含量最高，OFC中多酚得率和含量最低，這可能是鷓鴣茶中多酚是多羥基類化合物，易溶于水和乙醇，利用纖維素酶輔助提取能促進鷓鴣茶中多酚溶出。WFC得率、多酚含量與CFC、OFC沒有顯著性差異;OFC得率、含量與CFC有顯著性差異。

2.2 ?不同提取方法的鷓鴣茶多酚抗氧化性比較

2.2.1 ?清除DPPH自由基能力比較 ?由圖1可知，不同方法浸提的鷓鴣茶多酚提取物對DPPH自由基均具有清除作用，清除率與提取物質(zhì)量濃度呈量效依賴關(guān)系。這與Kwon等[27]報道，自由基清除能力與多酚質(zhì)量濃度增加成正相關(guān)關(guān)系的結(jié)果一致。WFC、OFC、CFC和Vc清除DPPH自由基的半抑制濃度（the half inhibitory concentration， IC50）值分別為（0.0037±0.0003）、（0.0074±0.0004）、 （0.0034±0.0002）、（0.0057±0.0003）mg/mL，說明CFC清除DPPH自由基能力最強，WFC和CFC清除DPPH自由基能力強于Vc，OFC清除DPPH自由基能力弱于Vc。這可能是浸提物中起抗氧化作用的多酚化合物種類與含量不同，引起抗氧化性差異。

2.2.2 ?清除ABTS自由基能力比較 ?由圖2可知，不同種方法浸提的鷓鴣茶多酚提取物對ABTS自由基均具有清除作用，清除率與提取物濃度呈量效依賴關(guān)系。WFC、OFC、CFC和Vc清除ABTS自由基IC50值分別為（0.066±0.004）、（0.137± 0.012）、（0.091±0.006）、（0.086±0.005）mg/mL，說明WFC清除ABTS自由基能力最強，強于Vc，CFC清除ABTS自由基能力與Vc相差不大。這與胡長玉等[28]等研究祁白術(shù)多酚清除ABTS自由基作用變化趨勢相似，但其清除能力弱于祁白術(shù)多酚（其IC50值為0.050 mg/mL），這是因為不同植物中多酚種類與結(jié)構(gòu)不同，表現(xiàn)出抗氧化性能力不同。

2.2.3 ?清除羥自由基能力比較 ?由圖3可知，不同種方法浸提的鷓鴣茶多酚提取物對羥自由基均具有清除作用，清除率與提取物質(zhì)量濃度呈量效依賴關(guān)系。WFC、OFC、CFC和Vc清除ABTS自由基IC50值分別為（0.069±0.004）、（0.118± 0.009）、（0.096±0.007）、（0.147±0.012）mg/mL，說明WFC、OFC、CFC清除ABTS自由基能力強于Vc，其中WFC清除ABTS自由基能力最強。WFC清除羥自由基的IC50值小于李花等[24]測定的鷓鴣茶水提物（其IC50值為0.0864 mg/mL），可能是原料產(chǎn)地、品種、葉片成熟度、采摘時間等多種因素差異引起。

2.2.4 ?清除超氧陰離子自由基能力比較 ?由圖4可知，不同種方法浸提的鷓鴣茶多酚提取物對超氧自由基均具有清除作用，清除率與提取物質(zhì)量濃度呈量效依賴關(guān)系。這與張秀芬等[29]測定辣木葉多酚超氧自由基作用變化趨勢一致，但清除作用強于辣木葉多酚（IC50值大于5 mg/mL）。WFC、OFC、CFC和Vc清除超氧自由基IC50值分別為（0.127±0.009）、（0.182±0.015）、（0.152±0.074）、（0.392±0.026）mg/mL，說明WFC、OFC、CFC清除ABTS自由基能力強于Vc，其中WFC清除ABTS自由基最強。

2.2.5 ?還原力比較 ?由圖5可知，WFC、OFC、CFC、Vc的還原力隨提取物質(zhì)量濃度增加而增加，還原力與提取物質(zhì)量濃度呈量效依賴關(guān)系。這與魏園園等[30]測定栓皮櫟橡子果仁多酚的還原力變化趨勢一致，但在樣品濃度0.04 mg/mL條件下，鷓鴣茶多酚提取物對Fe3+還原力更強。當WFC、OFC、CFC、Vc濃度為0.04 mg/mL時，對應(yīng)的吸光值0.508±0.016、0.414±0.035、0.467± 0.016、0.788±0.018，說明還原力Vc>WFC>CFC> OFC。

2.3 ?不同方法提取的鷓鴣茶多酚抑菌性比較

2.3.1 ?不同方法浸提的鷓鴣茶多酚提取物對4種細菌的抑菌圈的影響 ?由表2可知，不同方法浸提的鷓鴣茶多酚提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌均具有一定的抑制作用，不同提取方法對4種細菌的抑菌圈直徑有影響，這可能是因為不同方法浸提的鷓鴣茶多酚中起抑菌效果的化合物種類與含量不同。WFC、OFC、CFC均是對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強，其對大腸桿菌抑菌圈直徑依次為（12.34±1.01）、（10.83±0.62）、（11.52± 0.82）mm;對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑依次為（12.16±0.95）、（10.65±0.86）、（11.32±0.92）mm;對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最弱，其抑菌圈直徑依次為（2.12±0.15）、（1.96±0.13）、（2.06±0.15）mm。OFC對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑與李彥軍等[10]測定的鷓鴣茶提取物相似（依次為11.00、10.80、2.10 mm）。

2.3.2 ?不同方法浸提的鷓鴣茶多酚提取物對4種細菌的最小抑制濃度 ?由表3可知，不同方法浸提的鷓鴣茶多酚提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌均具有一定的抑制作用，不同提取方法對4種細菌的MIC有影響。WFC、CFC對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌的MIC均為3.13、3.13、12.50、6.25 mg/mL，說明WFC、CFC對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強。WFC對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的MIC與李花等[24]測定的鷓鴣茶水提物（分別為3.13、6.25 mg/mL）相同。

3 ?討論

目前關(guān)于多酚的提取方法較多，主要有熱水浸提法、有機溶劑浸提法、酶輔助提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等，每種方法因操作方法與提取條件不同各有優(yōu)勢，得率、多酚含量等也有差異。本研究在前期優(yōu)化熱水浸提法、有機溶劑浸提法、酶輔助提取法工藝基礎(chǔ)上，比較不同方法提取的鷓鴣茶多酚得率、含量、抗氧化性與抑菌性。根據(jù)結(jié)果，WFC、OFC、CFC得率分別為（10.31±0.42）%、（9.79±0.38）%、（10.88± 0.52）%;含量分別為（44.72±2.26）%、（39.54± 1.78）%、（47.07±2.52）%，CFC得率與含量最高，但只稍高于WFC，二者差異不顯著，這可能是纖維素酶可在短時間內(nèi)破壞細胞結(jié)構(gòu)，進而增加細胞壁和細胞膜的通透性，利于多酚溶出;鷓鴣茶多酚可能是多羥基的酚類化合物，易溶于水，采用熱水浸提法提取效果也較好。

自由基是一類瞬時形成含不成對電子的原子或功能基團。受控的自由基對人體有益，可以幫助傳遞維持生命的能量，殺滅病菌和寄生蟲，參與毒素排出。但自由基過多或失控，便會氧化細胞膜、酶、DNA及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，對機體造成損傷[31]。本研究測定3種方法提取鷓鴣茶多酚的5種體外抗氧化能力，得出CFC清除DPPH自由基能力最強，但其IC50值與WFC差別不大;WFC清除ABTS自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基能力及還原力最強，綜合測定結(jié)果，WFC體外抗氧化性最強，其清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基能力強于Vc，其IC50值分別為（0.0037±0.0003）、（0.066± 0.004）、（0.069±0.004）、（0.127±0.009）mg/mL，說明熱水浸提法提取的多酚化合物具有良好抗氧化活性，可以應(yīng)用于天然抗氧化劑領(lǐng)域。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為常見的致病菌，危害人體健康與食品安全;枯草芽孢桿菌為非致病菌，可用作處理工業(yè)和市政的污水，提高動物體內(nèi)巨噬細胞和干擾素活性。研究以上具有代表性的致病菌與非致病菌，有利于客觀評價鷓鴣茶多酚提取物的抑菌性。根據(jù)實驗結(jié)果，3種方法浸提的多酚提取物對4種細菌均有抑制作用，其中WFC對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌抑制效果最好，抑菌圈直徑依次為（12.34±1.01）、（12.16±0.95）、（2.12±0.15）、（6.12±0.36）mm，MIC依次為3.13、3.13、12.50、6.25 mg/mL，說明鷓鴣茶多酚提取物的抑菌活性較為廣譜，其對致病菌的抑制效果更好，非致病菌抑制效果弱，這與李花等[24]測定的鷓鴣茶水提物抑菌性結(jié)果一致?？梢栽诒３址侵虏【L前提下，抑制致病菌的生長，這也利用鷓鴣茶的生產(chǎn)應(yīng)用?？紤]到CFC得率與含量稍高于WFC，二者差異不顯著;WFC體外抗氧化性、抑菌性最強;WFC具有更低成本和更高食品安全性，鷓鴣茶多酚的提取采用熱水浸提法較為適宜。

研究結(jié)果說明，熱水浸提法提取鷓鴣茶多酚具有較強的抗氧化性與抑菌性，在食品抑菌防腐、天然抗氧化劑開發(fā)等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，下一步對其抗氧化、抑菌性成分與作用機理以及實際應(yīng)用等方面進行深入研究，以進一步提高鷓鴣茶的利用價值，也為鷓鴣茶在食品藥品領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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責(zé)任編輯：崔麗虹

收稿日期 ?2020-03-28;修回日期 ?2020-05-13

基金項目 ?海南省自然科學(xué)基金項目（No. 319QN328）;2018年海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新專項項目。

作者簡介 ?段宙位（1985—），男，博士，副研究員，研究方向：營養(yǎng)與功能食品。*通信作者（Corresponding author）：謝 ?輝（XIE Hui），E-mail：790586793@qq.com。