外源抗壞血酸對水稻抗鋁生理指標(biāo)的影響

周小華　李昆志　趙崢　張小玲　程霞　馮慶

摘 ?要：為探討外源抗壞血酸（AsA）對水稻的抗鋁性能的影響，以‘滇優(yōu)35號（雜交稻，粳稻）為試驗(yàn)材料，采用溶液培養(yǎng)法研究外源AsA對鋁脅迫下水稻根尖H2O2、內(nèi)源AsA、GSH、可溶性蛋白、脯氨酸含量及抗氧化酶活性等生理生化指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，與對照相比，鋁脅迫導(dǎo)致水稻根尖可溶性蛋白和內(nèi)源AsA含量減少，而MDA和H2O2含量，SOD、POD、APX和CAT活性，GSH及脯氨酸含量增加;外源AsA可增強(qiáng)鋁脅迫水稻根尖的脯氨酸及可溶性蛋白等含量，內(nèi)源AsA、GSH含量及SOD、POD、APX、CAT活性，而降低MDA和H2O2含量。表明外源AsA通過調(diào)控抗氧化酶活性，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和抗氧化物質(zhì)含量來降低H2O2的積累，從而緩解鋁脅迫下水稻質(zhì)膜氧化程度，增強(qiáng)水稻的抗鋁性能。

關(guān)鍵詞：水稻;鋁脅迫;抗壞血酸;抗氧化酶;滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

中圖分類號：S511 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Effects of Exogenous Ascorbic Acid on Physiological Indexes in Rice Under Aluminum Stress

ZHOU Xiaohua1， LI Kunzhi2， ZHAO Zheng1， ZHANG Xiaoling3， CHENG Xia4， FENG Qing1

1. Kunming Cooperative Research Center for Pollution Prevention of Dianchi （Lake）， Kunming University， Kunming， Yunnan 650214， China; 2. Faculty of Life Science and Biotechnology， Kunming University of Science and Technology， Kunming， Yunnan 650500， China; 3. Teaching Affairs Office， Kunming University， Kunming， Yunnan 650214， China; 4. Faculty of Agronomy and Life Sciences， Kunming University， Kunming， Yunnan 650214， China

Abstract： In order to investigate the effect of exogenous ascorbic acid （AsA） on aluminum resistance of rice， the ‘Dian Superior 35 （Hybrid， Japonica） was used as the hydroponical test material to study the influence of the physiological and biochemical indicators such as the contents of H2O2， endogenous AsA， GSH， the soluble protein， proline and the activity of the antioxidant enzyme， etc. in the rice root tips. The results showed that compared to the control， the contents of the soluble protein and endogenous AsA in the root were decreased， while the activities of SOD， POD， APX and CAT， the contents of MDA， H2O2， GSH and proline were significantly increased under aluminum stress， respectively， the exogenous AsA migth improve the contents of proline， the soluble protein， endogenous AsA and GSH， the activities of SOD， POD， APX and CAT， respectively， and decreased the contents of MDA and H2O2. The above results showed that exogenous AsA might alleviate the degree of the plasma membrane oxidation and promote aluminum resistance of rice by enhancing the activities of the antioxidant enzyme， the contents of osmoregulation substances and antioxidant substance which might reduce the accumulation of H2O2.

Keywords： rice; aluminum stress; ascorbic acid; antioxidant enzyme; osmoregulation substances

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.023

目前全球約50%的可耕土壤為酸性土壤，我國約有21%的可耕土壤為酸性土壤[1-2]，當(dāng)土壤pH<5.5時(shí)，土壤中難溶性鋁形態(tài)物質(zhì)就會(huì)因土壤的酸性而溶解釋放出Al3+，土壤中微摩爾級Al3+就會(huì)影響植物的生長，抑制植物吸收氮、磷等營養(yǎng)素[3]，鋁脅迫可導(dǎo)致玉米[4]、水稻[5]、甘薯[6]等作物減產(chǎn)。我國約為30%的水稻生長在酸性土壤上，鋁脅迫已成為限制水稻生長的主要影響因子之一。

通過外源物質(zhì)調(diào)節(jié)鋁脅迫下水稻的生長已有相關(guān)報(bào)道，外源脫落酸[7]、NO[8]等能有效緩解鋁脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷?？箟难崾侵参锏闹匾敲缚寡趸瘎?，也是植物體內(nèi)的一種多功能代謝物質(zhì)，可以直接或者間接地清理體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，維持植物體內(nèi)的氧化還原平衡，增強(qiáng)植物抗逆性[9]，其在植物逆境條件下的作用引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。已有研究表明，外源AsA可提高Na2SO4脅迫下燕麥幼苗根長及活力指數(shù)[10];能顯著增強(qiáng)高溫脅迫下水稻[11]、鉛脅迫下秋葵[12]及干旱脅迫下玉米[13]的抗氧化酶活性，以緩解環(huán)境脅迫對植株的傷害，提高植物的抗逆性。然而，關(guān)于外源AsA對水稻抗鋁的生理指標(biāo)的影響研究較少，本研究以4葉齡水稻幼苗為試驗(yàn)材料，探討外源AsA對鋁脅迫水稻幼苗根尖的H2O2含量與脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性、AsA和GSH抗氧化物質(zhì)含量等指標(biāo)的影響，闡明外源AsA對鋁脅迫水稻的生理生化反應(yīng)機(jī)制，為科學(xué)評價(jià)外源AsA對非生物脅迫下農(nóng)作物生長及其應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試水稻（Oryza sativa L.）為‘滇優(yōu)5號，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。種子經(jīng)消毒、浸泡、催芽，將露白的種子轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)液于25 ℃、光照[1200 μmol/（m2·s）] 12 h/d的溫室中漂浮培養(yǎng)和處理。

試劑：AlCl3，AR;抗壞血酸，AR。

水稻營養(yǎng)液（IRRI，國際水稻研究所）：K₂SO₄0.35、KH₂PO₄0.3、NH₄NO₃2.86、CaCl₂1.0、H₃BO₃2.0×10^–2、MnCl₂·4H₂O 9.0×10^–3、CuSO₄·5H₂O 3.2×10^–4、MgSO₄·7H₂O 1.0、（NH₄）₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.39×10^–4、Na₂SiO₃·9H₂O 5.0×10^–4、Na₂EDTA-Fe （Ⅱ） 2.0×10^–2、ZnSO₄·7H₂O 7.7×10^–4，單位：mmol/L。

1.2 ?方法

1.2.1? 材料的處理? 用含1/4濃度pH 4.5的水稻營養(yǎng)液（IRRI）培養(yǎng)至1葉齡幼苗，放至pH4.5水稻全營養(yǎng)液培養(yǎng)，每2 d更換1次營養(yǎng)液，待水稻長至4葉齡進(jìn)行鋁脅迫（0、50 μmol/L）處理^[14]。AsA最佳濃度實(shí)驗(yàn)是在含50 μmol/L AlCl₃的pH 4.5水稻全營養(yǎng)液中添加不同濃度（0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L）AsA處理24 h，分析根尖材料的H₂O₂含量，根據(jù)H₂O₂含量確定AsA最佳處理濃度;采用無鋁無AsA（–Al–AsA）、有鋁無AsA（+Al–AsA）、無鋁有AsA（–Al+AsA）和有鋁有AsA（+Al+AsA）處理24 h，以無鋁無AsA（–Al–AsA）組為對照，鋁以AlCl₃形式供給，每組3個(gè)重復(fù)，收集根尖材料備用。

1.2.2? 測定指標(biāo)及方法? 參照王學(xué)奎等^[15]的方法測定MDA、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖含量，根系活力，APX、SOD、POD、CAT活性;參照Nakano等^[16]的方法測定APX活性;參照Gay等^[17]的方法測定H₂O₂含量;參照賈新平等^[18]的方法測定質(zhì)膜透性;參照朱為民等^[19]的方法測定AsA和GSH含量。

1.2.2 ?測定指標(biāo)及方法 ?參照王學(xué)奎等[15]的方法測定MDA、可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸、可溶性糖含量，根系活力，APX、SOD、POD、CAT活性;參照Nakano等[16]的方法測定APX活性;參照Gay等[17]的方法測定H2O2含量;參照賈新平等[18]的方法測定質(zhì)膜透性;參照朱為民等[19]的方法測定AsA和GSH含量。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，Duncans法分析數(shù)據(jù)差異性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同AsA濃度對鋁脅迫水稻根尖H2O2含量的影響

不同AsA濃度處理鋁脅迫水稻24 h，與鋁脅迫組相比，根尖H2O2含量均有不同程度的減少（圖1）;≥1.0 mmol/L AsA處理組的H2O2含量顯著低于無AsA鋁脅迫組，2.0 mmol/L AsA處理組的H2O2含量顯著低于1.0 mmol/L AsA處理組;而大于2.0 mmol/L AsA處理組的H2O2含量與2.0 mmol/L AsA處理組無顯著差異，表明2.0 mmol/L AsA能較好地降低根尖H2O2含量。因此，均采用2.0 mmol/L AsA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 ?AsA對鋁脅迫水稻根系活力及質(zhì)膜相對透性的影響

根系活力反映植物根系的代謝水平和生長情況，直接影響植物營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與生長。有鋁無AsA（+Al–AsA）處理時(shí)根尖根系活力（圖2A）和質(zhì)膜相對透性（圖2B）含量分別為對照（–Al–AsA）的0.79倍和1.60倍，無鋁有AsA（–Al+AsA）處理組根系活力及質(zhì)膜透性與對照差異不大;有鋁有AsA（+Al+AsA）處理組分別為對照的0.93倍和1.22倍，為鋁脅迫（+Al–AsA）處理組的1.18倍和0.76倍，根系活力恢復(fù)到接近對照水平。表明外源AsA可以顯著提高鋁脅迫水稻根系活力并降低根尖質(zhì)膜透性，有助于維持細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的完整。

ability （B） under Al3+ stress

2.3 ?AsA對鋁脅迫水稻根尖MDA及H2O2含量的影響

鋁脅迫（+Al–AsA）處理組根尖MDA（圖3A）和H2O2（圖3B）含量分別為對照（–Al–AsA）的1.86倍和1.55倍，無鋁有AsA（–Al+AsA）處理組根尖MDA和H2O2含量為對照的1.02倍和1.05倍;有鋁有AsA（+Al+AsA）處理組根尖MDA和H2O2含量降低到對照（–Al–AsA）的1.50倍和1.15倍，為鋁脅迫（+Al–AsA）處理組的0.78倍和0.74倍。表明鋁脅迫使植株體內(nèi)MDA和H2O2含量升高，外源AsA可以有效地降低H2O2在水稻根部的積累，膜脂過氧化程度明顯下降。

2.4 ?AsA對鋁脅迫水稻根尖可溶性蛋白、可溶性糖及脯氨酸含量的影響

鋁脅迫（+Al–AsA）處理組水稻根尖可溶性蛋白質(zhì)含量（圖4A）顯著降低，為對照（–Al–AsA）的0.65倍，可溶性糖含量（圖4B）和游離脯氨酸含量（圖4C）顯著增加，分別為對照（–Al–AsA）的1.61倍和1.65倍;無鋁有AsA（–Al+AsA）處理組的可溶性糖、游離脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)含量與對照（–Al–AsA）無顯著差異;有鋁有AsA（+Al+AsA）處理組根尖可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脯氨酸含量分別為對照（–Al–AsA）的0.75倍、1.87倍和2.29倍，為鋁脅迫（+Al–AsA）組的1.15倍、1.16倍和1.39倍。表明外源AsA可提高根尖可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖及脯氨酸等滲透物質(zhì)的含量，有利于維持鋁脅迫水稻的質(zhì)膜滲透平衡。

2.5 ?AsA對鋁脅迫水稻根尖SOD、POD、CAT和APX活性的影響

鋁脅迫（+Al–AsA）處理組水稻根尖SOD（圖5A）、POD（圖5B）、CAT（圖5C）及APX（圖5D）活性分別是對照（–Al–AsA）的1.77倍、1.80倍、1.76倍和1.73倍;無鋁有AsA（–Al+AsA）處理組與對照（–Al–AsA）均無顯著差異;有鋁有AsA（+Al+AsA）處理組根尖的SOD、POD、CAT及APX活性分別為對照（–Al–AsA）的2.34倍、2.20倍、2.28倍和2.13倍，為鋁脅迫（+Al–AsA）處理組的1.26倍、1.22倍、1.29倍和1.23倍。表明鋁脅迫能增加根尖抗氧化酶的活性，外源AsA能更加突出這種增強(qiáng)效果，增強(qiáng)水稻清除ROS的能力。

2.6 ?AsA對鋁脅迫水稻根尖內(nèi)源AsA與GSH含量的影響

AsA與GSH是植物體內(nèi)非常重要的抗氧化物質(zhì)，植物抵抗非生物脅迫的能力與其含量呈正相關(guān)關(guān)系，在植物增強(qiáng)抗環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮重要作用[20]。鋁脅迫（+Al–AsA）處理組水稻根尖內(nèi)源AsA含量（圖6A）及GSH含量（圖6B）分別是對照（–Al–AsA）的0.93倍和1.36倍;無鋁有AsA（–Al+AsA）處理組是對照（–Al–AsA）的1.43倍和1.19倍;有鋁有AsA（+Al+AsA）處理組的AsA及GSH含量分別為對照（–Al–AsA）的1.32倍和1.73倍，為鋁脅迫（+Al–AsA）處理組的1.42倍和1.27倍。表明鋁脅迫降低了內(nèi)源AsA含量，但增加了GSH含量，外源AsA可增加鋁脅迫水稻根尖的內(nèi)源AsA和GSH含量。

2.7 ?不同生理生化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

采用SPSS21.0軟件對外源AsA處理鋁脅迫水稻根尖的H2O2含量（A）、MDA含量（B）、質(zhì)膜透性相對值（C）、可溶性蛋白含量（D）、可溶性總糖含量（E）、脯氨酸含量（F）、內(nèi)源AsA含量（G）、GSH含量（H）、根系活力（I）、SOD活性（J）、POD活性（K）、CAT活性（L）和APX活性（M）進(jìn)行雙變量相關(guān)分析。結(jié)果表明，鋁脅迫下水稻根尖MDA含量變化與CAT活性變化、內(nèi)源AsA含量變化與APX活性變化間呈顯著的正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)r分別為0.987和0.964（表1），表明外源AsA處理鋁脅迫水稻根尖MDA含量主要由CAT與APX活性來調(diào)控。

3 ?討論

外源AsA能增加鋁脅迫水稻滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的分泌量。脯氨酸和可溶性蛋白等能維持逆境脅迫的細(xì)胞滲透平衡和激發(fā)抗氧化酶活性，植物積累越多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，就有較強(qiáng)的逆境適應(yīng)能力[21]。本研究中，鋁脅迫導(dǎo)致根尖脯氨酸含量增加、可溶性蛋白含量下降，鋁脅迫水稻根尖正常的蛋白質(zhì)合成受到抑制，蛋白質(zhì)分解速度加快，導(dǎo)致其含量降低，通過增加脯氨酸含量保護(hù)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整性和提高酶的活性，提高水稻的抗鋁性能，這與通過提高脯氨酸和蛋白質(zhì)含量來增強(qiáng)油菜幼苗抗鋁性的研究結(jié)果相似[22]。外源AsA可使鋁脅迫水稻可溶性蛋白含量增加，其促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水合作用，分解速度下降所致，水稻脯氨酸含量增加更有利于保持質(zhì)膜的滲透平衡，這與華智銳等[23]的AsA可通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)分泌量來增強(qiáng)小麥抗鹽性的結(jié)論一致。說明外源AsA進(jìn)一步增強(qiáng)了脯氨酸和可溶性蛋白質(zhì)分泌量，緩解質(zhì)膜氧化損傷，有效地維持鋁脅迫水稻的細(xì)胞滲透平衡，增強(qiáng)水稻的抗鋁性能。

外源AsA可降低鋁脅迫水稻ROS的積累。MDA、H2O2常用于反映細(xì)胞質(zhì)膜氧化程度的生理指標(biāo)[24]。已有研究表明，鋁脅迫能加劇植物質(zhì)膜過氧化程度，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，從而導(dǎo)致植物體內(nèi)積累大量的H2O2等ROS[25-26]。本研究表明，鋁脅迫導(dǎo)致水稻根尖積累較多的MDA和H2O2，質(zhì)膜過氧化程度加劇，這與鋁脅迫誘導(dǎo)水稻、玉米R(shí)OS的大量積累的研究結(jié)果相似[27-29]。外源AsA可減少鋁脅迫水稻根尖MDA及H2O2的積累，AsA直接或間接參與了清除ROS的過程，在一定程度上降低ROS的積累，緩解鋁毒對質(zhì)膜的過氧化傷害，從而有利于維持水稻幼苗正常的生理生化反應(yīng)，這與外源AsA減少鹽脅迫小麥體內(nèi)的ROS含量的結(jié)果一致[30]。表明外源AsA可清除H2O2等ROS，降低鋁對水稻根系的過氧化水平，提高水稻的耐鋁能力。

外源AsA可提高鋁脅迫水稻的根系活力和質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的完整性。在逆境條件下，細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)因質(zhì)膜過氧化而受損，導(dǎo)致質(zhì)膜透性增大及根系活力下降[31-32]，本研究中，鋁脅迫導(dǎo)致水稻根尖質(zhì)膜相對透性增加，根系活力下降，鋁脅迫導(dǎo)致水稻根尖H2O2大量積累，加劇了細(xì)胞膜脂過氧化程度，破壞了質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而造成細(xì)胞膜透性增大和根尖活力下降，這與羅文姬等[30]和劉擁海等[33]研究的鋁脅迫尾桉、水稻根系質(zhì)膜相對透性增加，與黃玉婷等[34]研究的鋁脅迫草本植物根系活力降低的變化趨勢相似。外源AsA可降低鋁脅迫水稻質(zhì)膜相對透性并提高根系活力，AsA參與消除了H2O2等ROS過程，降低了水稻根系積累的H2O2量，緩解了鋁脅迫誘導(dǎo)的質(zhì)膜過氧化程度，維持了質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而降低質(zhì)膜相對透性并提高了根系活力。

外源AsA可提高鋁脅迫水稻的抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化酶活性。在逆境條件下，植物為了提高逆境脅迫的適應(yīng)能力，會(huì)啟動(dòng)體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)或提高抗氧化物質(zhì)含量以消除ROS，從而增強(qiáng)抵御逆境脅迫誘導(dǎo)的ROS對植物的傷害程度^[35-36]，本研究結(jié)果顯示，鋁脅迫導(dǎo)致水稻根尖SOD、POD、CAT及APX活性增加，表明鋁脅迫在一定程度上誘導(dǎo)了水稻根尖抗氧化酶基因的表達(dá)，提高了抗氧化酶活性，從而增加消除ROS的能力，研究結(jié)果與鄭陽霞等^[37]報(bào)道鋁脅迫豆瓣菜抗氧化酶活性增加的趨勢一致，鋁脅迫導(dǎo)致水稻內(nèi)源AsA含量減少，GSH含量增加，說明在鋁脅迫初期AsA直接參與清除ROS或者其作為APX的電子供體而降低了其含量，在脅迫后期主要通過抗氧化酶和GSH來清除ROS，這與Sharma等^[38]研究鋁脅迫降低水稻AsA含量的結(jié)果一致;外源AsA進(jìn)一步提高水稻根尖抗氧化酶活性，其通過減少降解生物大分子的速率或上調(diào)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)來提高抗氧化酶活性，研究結(jié)果與外源AsA提高玉米的抗氧化酶活性以增強(qiáng)玉米的抗旱能力的結(jié)果相似^[39];并可上調(diào)內(nèi)源AsA和GSH的生物合成，彌補(bǔ)鋁脅迫導(dǎo)致水稻內(nèi)源AsA的不足，維持較穩(wěn)定的還原環(huán)境和還原庫力水平，增強(qiáng)清除H₂O₂等ROS的能力，減少根尖ROS的積累，維持質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)完整性和化學(xué)成分的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高水稻的抗氧化能力，表明外源AsA通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量來提高水稻抗鋁能力。

MDA是逆境脅迫植物質(zhì)膜過氧化產(chǎn)物之一，其含量可表征ROS的積累程度，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)膜嚴(yán)重?fù)p傷，H₂O₂可在CAT作用下分解成無毒的H₂O和O₂，減少氧化損傷對植物的傷害;外源AsA通過上調(diào)鋁脅迫水稻內(nèi)源AsA的生物合成，補(bǔ)充鋁脅迫導(dǎo)致內(nèi)源AsA的不足，持續(xù)提高APX的電子供給能力，從而增強(qiáng)APX的活性，增強(qiáng)抗氧化損傷能力^[38]。雙重相關(guān)性分析結(jié)果表明，MDA含量變化與CAT活性變化、內(nèi)源AsA含量變化與APX活性變化呈顯著的正相關(guān)，表明外源AsA主要通過誘導(dǎo)水稻體內(nèi)的CAT、APX活性調(diào)控水稻鋁脅迫的應(yīng)答機(jī)制，以緩解鋁脅迫誘導(dǎo)的ROS對水稻的傷害程度。

綜上所述，外源AsA顯著提高了抗氧化酶活性及內(nèi)源AsA與GSH含量，減少ROS的積累，降低鋁誘發(fā)的膜脂過氧化水平，并提高了可溶性蛋白含量、可溶性糖含量及脯氨酸含量，將細(xì)胞滲透平衡和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)維持在較穩(wěn)定水平，從而增強(qiáng)了水稻的抗氧化能力。外源AsA主要通過提高CAT、APX活性及內(nèi)源AsA含量提高鋁脅迫水稻清除ROS的能力，從而有效地緩解了鋁脅迫對水稻根系造成的氧化損傷，增強(qiáng)水稻的抗鋁性能。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)

收稿日期 ?2020-05-05;修回日期 ?2020-05-22

基金項(xiàng)目 ?云南省高校聯(lián)合基金項(xiàng)目（No. 2018FH001-027）;昆明學(xué)院引進(jìn)人才科研項(xiàng)目（No. YJL18009）。

作者簡介 ?周小華（1973—），男，博士，副教授，研究方向：逆境植物營養(yǎng)與生理，E-mail：zxh200008@126.com。