白介素-36α在煙曲霉感染的人角膜上皮細胞免疫反應中的作用及其機制

張子悅 鄭恒睿 馬玉娜 吳媛 王謙 徐強 張杰 林靜

(青島大學附屬醫(yī)院眼科，山東 青島 266003)

真菌性角膜炎是一種高致盲率的感染性角膜病變。近年來，真菌性角膜炎發(fā)病率逐年升高，廣譜抗生素、糖皮質激素以及角膜接觸鏡的不規(guī)范使用，都增加了真菌性角膜炎的發(fā)病風險[1]。煙曲霉菌是我國真菌性角膜炎主要致病真菌之一[2]，而在煙曲霉菌感染中適當的炎癥反應對致病病原體的清除至關重要[3]。白細胞介素-36(IL-36)是近年來新發(fā)現的IL-1細胞因子家族成員，可以與特異性IL-36受體(IL-36R)結合，激活胞內信號傳導通路，發(fā)揮促炎作用。IL-36由IL-36α、IL-36β和IL-36γ組成，與多種炎癥性疾病有關[4]。在流感病毒小鼠肺炎模型中，肺泡上皮細胞中IL-36α表達量高于IL-36γ，并且IL-36α能夠加速炎癥細胞因子和趨化因子的分泌[5]。IL-36α可與IL-36R特異性結合，激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子κB(NF-κB)信號轉導途徑[6]，促進趨化因子等多種細胞因子分泌[7]，在潰瘍性結腸炎或腎炎等多種炎性疾病中起到促炎作用[8-10]。已有研究證明，念珠菌感染后口腔黏膜上皮細胞中IL-36α以及IL-36γ的表達增加，經IL-36R信號通路生成IL-17、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等促炎因子，發(fā)揮促炎作用[11-13]。GUO等[14]研究顯示，銅綠假單胞菌感染的小鼠角膜中IL-36α的表達顯著升高，促進上皮細胞分泌多種炎癥因子并促進細菌清除，提示IL-36α在感染性角膜炎中高表達并起到促炎作用。但IL-36α在煙曲霉菌感染的角膜上皮細胞中的表達情況及其作用機制，尚未見相關研究報道。本研究通過體外實驗探討IL-36α在煙曲霉菌感染的角膜上皮細胞中的表達情況，以進一步揭示IL-36α在真菌性角膜炎免疫反應中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

永生化人角膜上皮細胞(HCEC)由廣州市中山眼科中心眼表實驗室提供，煙曲霉菌(菌株3.0772)購自中國微生物中心，人IL-36α重組蛋白(rhIL-36α)、人IL-36Ra重組蛋白(rhIL-36Ra)均購自美國R&D System公司，IL-36α、IL-36R多克隆抗體購自美國圣約翰公司，磷酸化NF-κB p65(pNF-κB p65)、NF-κB p65抗體購自美國Cell Signaling Tecnology公司，RNA裂解液購自中國大連TaKaRa生物公司，IL-8、TNF-α ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1煙曲霉菌滅活菌絲的制備 取冷凍保存的煙曲霉菌標準菌株，具體培育方式參考FAN等[3]的實驗。使用DMEM高糖培養(yǎng)液將煙曲霉菌滅活菌絲終濃度調整為1.0×108CFU/L。

1.2.2HCEC細胞的培養(yǎng)及煙曲霉菌菌絲刺激實驗 將HCEC細胞均勻接種于含有體積分數0.1的胎牛血清以及體積分數為10 g/L的青鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)基的6孔或者12孔培養(yǎng)板中，于37 ℃含體積分數0.05 CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，當HCEC細胞匯合度約為80%時，以無菌PBS洗滌以后更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，2 h以后再加入5×108CFU/L煙曲霉菌滅活菌絲刺激HCEC細胞。

1.2.3RT-PCR實驗檢測HCEC細胞中IL-36α、IL-36R、IL-8及TNF-α mRNA表達水平 以煙曲霉菌滅活菌絲刺激HCEC細胞0、4、8、12、16 h后，檢測各個時間點HCEC細胞中IL-36α、IL-36R mRNA表達。將HCEC細胞分為A、B、C組,A組僅給予100 μg/L的IgG重組蛋白處理HCEC細胞8 h，而B、C組分別給予100 μg/L IgG重組蛋白、100 μg/L rhIL-36α預處理細胞1 h后加入煙曲霉菌滅活菌絲刺激HCEC細胞8 h，檢測A、B、C組HCEC細胞中IL-8及TNF-α mRNA表達水平。按照實驗需要將HCEC細胞分為G、H、I組，G組為單純DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h的HCEC細胞，H組給予煙曲霉菌滅活菌絲刺激8 h，I組給予Dectin-1中和抗體預處理HCEC細胞2 h后,加入煙曲霉滅活菌絲刺激HCEC細胞8 h后，檢測G、H、I組中IL-36α mRNA的表達水平。將細胞收集于500 μL RNA裂解液中，以分光光度法測得RNA樣本濃度后計算逆轉錄加樣量。根據諾維贊逆轉錄試劑盒說明書的要求逆轉錄獲得cDNA原液20 μL，使用DEPC水按照1∶25稀釋后，取2 μL稀釋液用于RT-PCR實驗，最終總反應體積為20 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性 45 s，60 ℃退火、延伸 30 s，95 ℃溶解15 s。實驗重復3次，計算mRNA的表達水平。搜索GeneBank中人類β-actin、IL-36α、IL-36R、IL-8以及TNF-α對應的mRNA序列，委托中國大連TaKaRa生物公司設計合成引物。引物序列見表1。

1.2.4Western Blot方法檢測HCEC細胞中IL-36α、IL-36R、NF-κB p65及pNF-κB p65蛋白的表達接種于6孔板中的HCEC細胞以煙曲霉菌滅活菌絲刺激0、8、12、24 h，檢測各個時間點HCEC細胞中IL-36α、IL-36R蛋白表達變化。按照實驗需要將HCEC細胞分為D、E、F組，D組為DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h的HCEC細胞，E、F組分別給予100 μg/L rhIL-36α+rhIL-36Ra及100 μg/L rhIL-36α處理細胞12 h，檢測D、E、F組細胞中NF-κB p65、pNF-κB p65蛋白的表達變化。按照實驗需要將HCEC細胞分為G、H以及I組，G組為DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h的HCEC細胞，H組給予煙曲霉菌滅活菌絲刺激12 h，I組給予Dectin-1中和抗體預處理HCEC細胞2 h后,加入煙曲霉滅活菌絲刺激HCEC細胞12 h后，檢測G、H、I組細胞中IL-36α蛋白表達的變化。收集HCEC細胞于提前配制好的RIPA/PMSF蛋白裂解液中，每孔100 μL。冰上裂解2 h后，提取總蛋白并測定蛋白濃度，計算上樣量，加入SDS-蛋白上樣緩沖液并于109 ℃恒溫加熱器中加熱7 min。另根據目的條帶的相對分子量，制備體積分數為0.15的SDS-PAGE膠。跑膠的條件為：80 V恒壓電泳60 min，轉110 V恒壓電泳90 min。低溫250 mA濕轉2 h后，使用PBST溶液洗膜，室溫封閉2 h。4 ℃條件下孵育IL-36α、IL-36R、NF-κB p65、pNF-κB p65(phospho-NF-κB p65)及內參β-actin一抗(稀釋濃度均為1∶1 000)12 h，復溫1 h后PBST洗膜，加入1∶5 000倍稀釋后羊抗兔來源二抗室溫孵育2 h，使用ECL Western Blot方法檢測試劑顯影目的條帶，采用Image J軟件統(tǒng)計各組灰度值,結果取3次重復實驗的均值。

1.2.5ELISA實驗檢測HCEC細胞中IL-8以及TNF-α在不同處理條件下蛋白表達的變化 HCEC細胞接種于12孔板上，A組僅給予100 μg/L的IgG重組蛋白處理HCEC細胞12 h，B、C組分別給予100 μg/L IgG重組蛋白、100 μg/L rhIL-36α預處理細胞1 h以后，加入煙曲霉菌滅活菌絲刺激HCEC細胞12 h，收集細胞上清液離心后取上清液，根據試劑盒說明書檢測各組細胞中IL-8以及TNF-α蛋白的表達水平。所有樣本均通過雙復孔檢測，具體操作按試劑盒說明書進行，用酶標儀在波長450 nm處測量的各個孔的吸光度值后減去在波長570 nm處測量的吸光度值，計算出各例標本中所測因子蛋白的含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 IL-36α在煙曲霉菌刺激的HCEC細胞中表達比較

RT-PCR檢測結果顯示，煙曲霉滅活菌絲刺激HCEC細胞，0、4、8、12、16 h后IL-36α mRNA的表達量分別為1.13±0.42、3.47±0.16、3.59±0.90、4.34±0.73、7.89±0.44，各時間點比較差異具有顯著性(F=21.88，P<0.05)。IL-36R mRNA在0、4、8、12、16 h的表達量分別為0.43±0.17、1.21±0.50、6.45±0.17、6.17±0.68、5.46±1.32，各時間點比較差異均具有顯著意義(F=92.76，P<0.05)。Western Blot方法檢測結果示，0、8、12、24 h時IL-36α蛋白的表達量分別為7.61±0.30、10.04±0.41、10.73±0.42、14.15±0.51，IL-36R蛋白的表達量則分別為2.41±0.24、5.30±0.26、5.98±0.17、6.83±0.16，各時間點比較差異具有顯著意義(F=249.74、260.18，P<0.05)。

2.2 IL-36α對煙曲霉感染的HCEC細胞促炎細胞因子表達的影響

各組細胞中IL-8和TNF-α蛋白與mRNA水平比較差異有顯著性(F=11.54～95.42，P<0.05)；C組中IL-8、TNF-α蛋白與 mRNA的表達水平較B組升高，差異有顯著性(P<0.05)。見表2。

表2 各組HCEC細胞中IL-8、TNF-α蛋白和mRNA表達水平比較

2.3 各組細胞中pNF-κB p65及NF-κB p65蛋白表達的比較

Western Blot方法檢測結果顯示，D、E、F組中HCEC細胞中pNF-κB p65蛋白的相對表達量分別為3.18±0.35、4.33±0.29、4.72±0.10，差異具有顯著性(F=26.51，P<0.05)；與D、E組相比，F組中pNF-κB p65蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)。D、E、F組中NF-κB p65蛋白的相對表達量分別為0.70±0.12、1.28±0.07、1.60±0.08，差異具有顯著性(F=37.96，P<0.05)；與D組相比，E、F組中NF-κB p65蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05)。

2.4 各組細胞中IL-36α蛋白以及mRNA表達水平的比較

RT-PCR結果顯示，G、H、I組HCEC細胞中IL-36α mRNA相對表達量分別為0.69±0.21、4.31±0.28、1.28±0.46，差異具有顯著性(F=70.99，P<0.05)；與H組相比，I組IL-36α mRNA表達水平明顯下降(P<0.05)。Western Blot實驗結果顯示，G、H、I蛋白相對表達量分別為1.30±0.07、2.85±0.15、2.10±0.14，差異具有顯著性(F=34.26，P<0.05)；與H組相比，I組HCEC細胞IL-36α蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

煙曲霉菌感染引起的真菌性角膜炎是一種嚴重的感染性眼病，因缺乏有效的治療方式，致盲率一直居高不下[15-17]。IL-36α是新型細胞因子IL-1家族成員，在多種炎性疾病中與IL-36R結合后激活下游信號通路，誘導促炎因子的產生[4，7，18]。在煙曲霉菌引起的HCEC細胞的感染中，IL-36α表達升高并起到促炎作用，加重了角膜的炎癥反應。

本研究結果顯示，經煙曲霉菌刺激的HCEC細胞與正常HCEC細胞相比，IL-36α和IL-36R的蛋白及mRNA水平均明顯升高。已有研究證實，在正常生理條件下，IL-36α在皮膚、腦、外周血細胞、肺、腸等多種細胞、組織和器官中均有表達，當受到LPS、微生物等病原體刺激后[19-21]，如白色念珠菌感染的口腔黏膜上皮等組織中[11]，IL-36α表達升高，引起組織炎癥反應。本實驗結果顯示，IL-36α在煙曲霉菌滅活菌絲刺激的HCEC細胞中表達升高，提示IL-36途徑可能參與煙曲霉感染引起的免疫炎癥反應，IL-36α可能在煙曲霉菌感染的早期免疫反應中起著重要的作用。

本實驗進一步檢測了經rhIL-36α預處理后，煙曲霉菌感染的HCEC細胞中促炎因子的表達情況。結果顯示，rhIL-36α顯著上調了煙曲霉菌感染的角膜組織中促炎因子IL-8、TNF-α的表達。IL-8以及TNF-α是免疫反應中重要的趨化因子和炎癥因子，可以激活免疫細胞。實驗中外源性使用IL-36α重組蛋白增加了煙曲霉菌引起的HCEC細胞促炎因子的產生，進一步說明IL-36α誘導促炎因子的產生并加重煙曲霉菌感染后HCEC細胞中的炎癥反應。GUO等[14]的研究證實，IL-36α在銅綠假單胞菌角膜炎中表達顯著增高，并促進HCEC細胞分泌多種促炎因子。本實驗證明煙曲霉菌的刺激可以引起HCEC細胞當中IL-36α表達水平升高，外源性的rhIL-36α的加入上調了炎癥因子的表達，因此在真菌性角膜炎中IL-36α起到促炎作用。

在腎小管上皮細胞中IL-36細胞因子可以通過IL-36R激活NF-κB，在IL-36R基因敲除小鼠腎組織中NF-κB的活化降低[13]。NF-κB是炎癥級聯反應的關鍵調節(jié)因子，可以快速響應炎性刺激并控制炎癥細胞因子的轉錄(如IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α)[22-23]。NF-κB的激活涉及自身磷酸化和隨后的抑制蛋白IκB蛋白的水解，隨后磷酸化的NF-κB易位至細胞核并啟動下游炎性遞質的轉錄[24-25]。已有研究證明，諸如煙曲霉等細胞外刺激可促進IκB的水解，然后實現NF-κB易位到細胞核中并與鄰近“靶標”基因序列結合,IL-36α可以通過IL-36R激活NF-κB[7，23，26]。另外與IL-36α不同，IL-36Ra是IL-36R的負調控因子，IL-36Ra競爭性結合IL-36R從而抑制IL-36胞內信號的轉導[27]。本研究Western Blot方法檢測結果顯示,與E組相比，F組HCEC細胞中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平明顯增強，rhIL-36Ra的加入則明顯抑制了NF-κB的磷酸化。于急性腎損傷(AKI)模型中，外源性加入IL-36α可以上調腎小管上皮細胞中NF-κB活性，從而促進下游炎癥因子的產生[6]。在本實驗中，外源性加入人IL-36α重組蛋白顯著上調了NF-κB的磷酸化水平，提示IL-36α的促炎作用可能是通過活躍的NF-κB信號途徑起作用。

在人外周血單個核細胞(PBMC)中，煙曲霉對于IL-36α的誘導是通過Dectin-1/Syk和TLR4途徑介導的[13，28-30]。本次實驗中，在煙曲霉菌刺激HCEC細胞之前用Dectin-1中和抗體預處理阻斷Dectin-1通路后，RT-PCR及Western Blot方法檢測結果表明，Dectin-1中和抗體預處理組煙曲霉菌滅活菌絲刺激引起的IL-36α的表達顯著降低?；蛟S可以推斷，在HCEC細胞中煙曲霉菌誘導的的IL-36α表達升高可能是通過Dectin-1途徑介導的。

總之，本實驗的研究結果證明了煙曲霉菌刺激的HCEC細胞通過Dectin-1介導的信號通路提高了IL-36α的表達，并誘導炎癥因子加重炎癥反應。同時，在HCEC細胞中，IL-36α可通過IL-36R/NF-κB信號通路進一步發(fā)揮促炎作用，IL-36α可提高炎癥因子的表達，炎癥因子TNF-α等的刺激還可以使IL-36α的表達進一步上調，形成正反饋通路，放大炎癥反應。