GPX4對erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的影響及其機(jī)制

鄭憲鑫 張京 肖丹丹 王建勛

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071)

鐵死亡(ferroptosis)是一種依賴鐵的程序性細(xì)胞死亡形式，其特征是谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)活性喪失和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高[1]。多種疾病與鐵死亡有關(guān)，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤以及缺血再灌注引起的心血管系統(tǒng)疾病等[2-5]。因此，針對調(diào)控心肌細(xì)胞鐵死亡的研究，對探討心血管疾病新的治療方法具有重要意義。

GPX4是鐵死亡調(diào)控通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，保護(hù)細(xì)胞免于脂質(zhì)ROS傷害[6-7]。細(xì)胞內(nèi)GPX4活性下降或GPX4直接降解會引發(fā)鐵依賴性活性氧增加，進(jìn)而誘發(fā)鐵死亡[8-9]。GPX4介導(dǎo)的鐵死亡在機(jī)體發(fā)育過程中具有多種作用。研究發(fā)現(xiàn)，GPX4基因敲除小鼠體內(nèi)脂質(zhì)ROS過量積累，可導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡[10-11]；在體外大鼠心肌梗死模型中，心肌細(xì)胞中GPX4表達(dá)量降低[12]，說明GPX4也與心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。但GPX4在心肌細(xì)胞鐵死亡發(fā)生過程中的具體作用還不明確。研究發(fā)現(xiàn)，核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(NRF2)與腫瘤細(xì)胞鐵死亡的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)，通過敲除腫瘤細(xì)胞中的NRF2，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡[2,13]，而且NRF2對GPX4具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[14]。但NRF2與GPX4在心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡中的作用還有待進(jìn)一步研究。本研究通過鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鐵死亡，探究GPX4和NRF2對erastin誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

BODIPYTM581/591 C11及Lipofectamine3000(美國Invitrogen公司)，RNA反轉(zhuǎn)試劑盒(日本TaKaRa公司)，GPX4單克隆抗體(美國Abcam公司)，NRF2單克隆抗體(中國ABclonal公司)，GPX4、NRF2以及GAPDH的引物(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，erastin、Ferrostatin-1(Fer-1)、Z-VAD-FMK(Z-VAD)、Deferoxamine(DFO)以及Necrostatin-1(Nec-1)(美國Abmole公司)，丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)，GPX4過表達(dá)質(zhì)粒(中國華大基因)，NRF2過表達(dá)質(zhì)粒以及GPX4-RNAi(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將H9C2細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)至合適密度后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞分組 將每孔約5.0×105個H9C2細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi),待H9C2細(xì)胞融合度為40%左右時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將H9C2細(xì)胞分為6組，A組為對照組，B～F組分別為經(jīng)erastin(5 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+Fer-1(5 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+DFO(100 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+Z-VAD(10 μmol/L)、erastin(5 μmol/L)+Nec-1(50 μmol/L)處理組。同時，再將H9C2細(xì)胞分為5組，G～K組分別為經(jīng)過erastin(5 μmol/L)+pc DNA3.1、erastin(5 μmol/L)+GPX4、erastin(5 μmol/L)+siGPX4-scr、erastin(5 μmol/L)+si-GPX4、erastin(5 μmol/L)+NRF2處理組。

1.2.3實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測H9C2細(xì)胞中GPX4、NRF2 mRNA相對表達(dá)水平將每孔約5.0×105個H9C2細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)，按照1.2.2中A～C組的方法處理細(xì)胞24 h后，采用Trizol法提取常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進(jìn)行RT-qPCR。根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，以GAPDH作為內(nèi)參照，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。反應(yīng)的條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。采用2-△△CT計(jì)算樣本中GPX4以及NRF2 mRNA的相對表達(dá)水平。GPX4引物：正向5′-GAGGCAGGAGCCAGGAA-GT-3′，反向5′-ACAGTGGGTGGGCATCGTC-3′。NRF2引物：正向5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′，反向5′-GGAATGTCTGCGCCAAA-AGCTG-3′。GAPDH引物：正向5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，反向5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

1.2.4PI染色檢測細(xì)胞死亡率 待H9C2細(xì)胞融合度為40%左右時，按照1.2.2中A～K組的方法處理細(xì)胞24 h后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，使用多聚甲醛對細(xì)胞固定超過30 min，固定完成后，吸出多聚甲醛，再使用PBS洗滌3次以后，按照Hoechst33342/PI雙染試劑盒說明書操作，最后于熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞死亡情況。細(xì)胞死亡的百分比計(jì)算方法為細(xì)胞PI陽性數(shù)量除以Hoechst33342染色的細(xì)胞核總數(shù)。

1.2.5Western blot方法檢測細(xì)胞中GPX4、NRF2蛋白相對表達(dá)量 待H9C2細(xì)胞融合度為40%左右時，按照1.2.2中A～C組的方法處理細(xì)胞24 h后，收集心肌細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。按照SDS-PAGE凝膠制備說明書配置150 g/L的分離膠以及50 g/L的濃縮膠，電泳、轉(zhuǎn)膜，然后以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶500)室溫孵育2.5 h，同時以β-actin作為內(nèi)參照。TBST洗膜3次后，二抗室溫孵育1 h，重復(fù)上述洗膜步驟，顯影，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值計(jì)算，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值。

1.2.6熒光分光光度法檢測細(xì)胞中MDA的含量將H9C2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約5×105個細(xì)胞，待細(xì)胞融合度為40%左右時，將細(xì)胞按照要求分為A～K組。處理24 h后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，根據(jù)MDA檢測試劑盒說明書操作，收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清液；按照每500萬個細(xì)胞加入 1 mL提取液，超聲波破碎細(xì)胞，最后使用熒光分光光度法測量細(xì)胞中MDA的含量。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞脂質(zhì)ROS的含量 將H9C2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔約5×105個細(xì)胞，待細(xì)胞融合度為40%左右時，將細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)要求分為A～K組。處理24 h后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，根據(jù)BODIPYTM581/591 C11檢測試劑盒說明書操作，收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清液，PBS重懸，濾網(wǎng)過濾后使用流式細(xì)胞術(shù)檢測脂質(zhì)ROS的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Erastin及其抑制劑對H9C2細(xì)胞的死亡率及脂質(zhì)過氧化的影響

經(jīng)erastin及其抑制劑處理后進(jìn)行PI染色，結(jié)果顯示，C、D組細(xì)胞死亡數(shù)量很少，而E、F組可見大量細(xì)胞死亡(圖1)；A～F組細(xì)胞死亡率以及脂質(zhì)ROS、MDA含量比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)意義(F=22.380～259.500，P<0.05)，其中C、D組與B組比較，上述3個指標(biāo)均明顯降低(t=4.056～45.500,P<0.05)。見表1。

2.2 過表達(dá)GPX4對erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的影響

經(jīng)erastin及轉(zhuǎn)染過表達(dá)GPX4質(zhì)粒處理后，A、B、G、H組細(xì)胞死亡率及脂質(zhì)ROS、MDA含量比較差異均有顯著意義(F=4.069～488.900，P<0.05)，其中H組與G組比較，上述3個指標(biāo)均明顯降低(t=2.044～16.750,P<0.05)。見表1。

2.3 抑制GPX4對erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的影響

經(jīng)erastin及轉(zhuǎn)染敲低GPX4的siRNA處理后，A、B、I、J組細(xì)胞死亡率及脂質(zhì)ROS、MDA含量比較差異均有顯著意義(F=19.880～363.200，P<0.05)，其中J組與I組比較，上述3個指標(biāo)均明顯升高(t=2.925～10.280,P<0.05)。見表1。

A～F分別為A～F組圖1 A～F組H9C2細(xì)胞的死亡情況

2.4 過表達(dá)NRF2對erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的影響

經(jīng)erastin及轉(zhuǎn)染過表達(dá)NRF2質(zhì)粒處理后，A、B、G、K組細(xì)胞死亡率及脂質(zhì)ROS、MDA含量比較差異有顯著性(F=3.786～99.120，P<0.05)，其中K組與G組比較，上述3個指標(biāo)均明顯降低(t=1.873～8.315,P<0.05)。見表1。

表1 A～K組H9C2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡情況比較

2.5 Erastin及抑制劑Fer-1對H9C2細(xì)胞GPX4、NRF2 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平的影響

經(jīng)erastin及抑制劑Fer-1處理以后,A～C組H9C2細(xì)胞的GPX4、NRF2 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平比較差異均具有顯著性(F=8.277～42.570，P<0.05)，其中C組與B組比較，上述指標(biāo)均明顯升高(t=3.320～9.803,P<0.05)。見表2。

表2 A～C組H9C2細(xì)胞的GPX4、NRF2 mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平比較

3 討 論

心血管疾病是最常見和最具危害的疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康?，F(xiàn)在越來越多的研究證據(jù)表明，鐵代謝異常與心血管疾病密切相關(guān)。鐵蛋白重鏈(FTH)在鐵代謝和心臟疾病發(fā)病過程中中具有重要作用[15]。有研究證實(shí)，在特異性敲除心臟轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Tfr)基因的小鼠中，心臟缺鐵嚴(yán)重，最后致小鼠死亡[16]。在特異性敲除心臟ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCB8)小鼠中，心肌細(xì)胞中出現(xiàn)鐵蓄積，并最終發(fā)展為心肌病[17]。由此可以推測，鐵缺乏和鐵超載與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]。但是，鐵參與心血管疾病的具體損傷機(jī)制目前仍不清楚，因此，該領(lǐng)域的研究將是未來心血管系統(tǒng)疾病治療的新方向。

鐵死亡是依賴于鐵的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式。鐵死亡概念的提出，對解決鐵代謝與心血管系統(tǒng)疾病的關(guān)系，提供了新的思路。研究報(bào)道抑制鐵死亡可以減輕小鼠心臟缺血再灌注損傷[19]。鐵死亡抑制劑Fer-1可以顯著降低阿霉素導(dǎo)致的心肌毒性[20]。GPX4作為鐵死亡調(diào)控通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，使用GPX4特異性抑制劑RSL3抑制其活性，或者RNA干擾抑制內(nèi)源性GPX4的表達(dá)，都會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)ROS積累觸發(fā)鐵死亡[21]。本研究經(jīng)鐵死亡抑制劑Fer-1處理H9C2細(xì)胞后，結(jié)果顯示細(xì)胞死亡率及脂質(zhì)ROS、MDA含量明顯降低，表明Fer-1能夠抑制erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞死亡。為了探究GPX4在erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞鐵死亡中發(fā)揮的作用，本研究構(gòu)建了GPX4過表達(dá)載體，將H9C2細(xì)胞經(jīng)erastin及轉(zhuǎn)染GPX4過表達(dá)質(zhì)粒處理后，結(jié)果顯示細(xì)胞死亡率以及脂質(zhì)ROS、MDA含量均明顯降低，提示過表達(dá)GPX4可以抑制erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞鐵死亡和脂質(zhì)過氧化；同時本研究又構(gòu)建了敲低GPX4的si-RNA， 在將H9C2細(xì)胞經(jīng)erastin及si-GPX4處理后，結(jié)果顯示細(xì)胞死亡率及脂質(zhì)ROS、MDA含量均明顯增高，提示抑制GPX4的內(nèi)源性表達(dá)可以促進(jìn)erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞鐵死亡和脂質(zhì)過氧化。以上結(jié)果表明GPX4在erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞鐵死亡中發(fā)揮著保護(hù)作用。

NRF2是鐵死亡中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在鐵、脂質(zhì)和谷胱甘肽代謝中都發(fā)揮重要作用[22-24]。并且發(fā)現(xiàn)NRF2與阿爾茨海默病、呼吸系統(tǒng)疾病以及腫瘤等疾病也密切相關(guān)[14,22,25]。NRF2敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟梗死面積增加，表明NRF2與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關(guān)[26]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，GPX4是NRF2轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的基因，因此NRF2與GPX4存在靶向調(diào)控關(guān)系[14]，但是在心血管系統(tǒng)疾病中的作用還不是很清楚。為了進(jìn)一步探究NRF2是否參與調(diào)控了GPX4的表達(dá)，本研究構(gòu)建了NRF2的過表達(dá)的質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H9C2細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染NRF2過表達(dá)質(zhì)粒處理后，GPX4的表達(dá)也增加。H9C2細(xì)胞經(jīng)erastin及轉(zhuǎn)染過表達(dá)NRF2質(zhì)粒處理后，細(xì)胞死亡率以及脂質(zhì)ROS、MDA含量均明顯降低，提示NRF2可以抑制erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞鐵死亡和脂質(zhì)過氧化。為此推測NRF2對GPX4的調(diào)控是GPX4發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵。

綜上所述，本研究通過對H9C2細(xì)胞經(jīng)erastin以及GPX4、NRF2進(jìn)行過表達(dá)處理后，發(fā)現(xiàn)GPX4和NRF2均參與了調(diào)控erastin誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡過程，NRF2可能是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控GPX4發(fā)揮作用的，本研究為心血管系統(tǒng)疾病鐵死亡的研究提供了更多的理論依據(jù)。