HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌患者循環(huán)血miR-155水平與相關(guān)免疫細(xì)胞因子、HBV-DNA載量的關(guān)系及意義

杜敬佩 王園園 李長(zhǎng)安 趙巍峰

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院感染性疾病科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

近些年來，逐漸發(fā)現(xiàn)了較多的與原發(fā)性肝癌(PHC)發(fā)病相關(guān)的微小RNA(miRNA)，并成為臨床診斷和治療中最具潛力的生物分子標(biāo)志物[1]。而且由于缺乏免疫原性，某些miRNAs也逐漸成為抗病毒治療的理想靶點(diǎn)[2]。眾多循證醫(yī)學(xué)研究業(yè)已證實(shí)，乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的急慢性肝疾病是PHC發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3-5]；而且我國(guó)也屬于HBV高感染地區(qū)，90%以上的PHC患者都具有HBV感染背景[6]。因此，本研究從靶基因水平尋找與HBV相關(guān)miRNA，并進(jìn)一步分析其與HBV相關(guān)PHC發(fā)生、HBV病毒載量、相關(guān)免疫細(xì)胞因子的關(guān)系，旨在為PHC的早期診斷及靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集2019年1月—2020年3月于我院肝病科乙肝表面抗原(HBsAg)或HBV-DNA檢測(cè)陽(yáng)性患者的血液樣本共180例。包括HBV相關(guān)PHC患者(PHC組)75例，乙型肝炎肝硬化患者(HBV-LC組)45例，慢性乙型肝炎患者(CHB組)30例，無癥狀慢性HBV攜帶者(HBV組)30例。所有患者采集血液樣本前均未行外科手術(shù)或其他抗癌治療，其中HBV組患者經(jīng)相關(guān)血清學(xué)檢查確診，HBV-LC組經(jīng)肝穿刺活檢或影像學(xué)檢查確診，PHC患者經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診；排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他肝炎病毒感染、酒精、自身免疫、代謝因素等引起的肝臟疾??；②合并心、腎等功能嚴(yán)重障礙者或其他惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病者。根據(jù)PHC患者肝功能狀態(tài)、腫瘤特點(diǎn)、治療方式等進(jìn)行BCLC分期。另外收集同時(shí)期健康人群血液樣本50例作為對(duì)照組，各項(xiàng)生化指標(biāo)均在正常參考范圍內(nèi)且體格檢查、影像學(xué)檢查等均無異常。各組受檢者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史者比例，差異無顯著意義(P>0.05)。本研究所有受檢者均簽署了知情同意書，并符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肝功能檢測(cè) 采用UniCelDxI800免疫分析儀(美國(guó)Backman-Coulter公司)檢測(cè)所有受檢者血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(T-BIL)以及血清白蛋白(ALB)的水平。根據(jù)臨床生化指標(biāo)，包括肝性腦病(期)、腹水、血清T-BIL水平、ALB水平、凝血酶原時(shí)間進(jìn)行肝功能Child-Pugh分級(jí)，分為A級(jí)：5～6分，B級(jí)：7～9分，C級(jí)：>9分。

1.2.2血漿總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)方法檢測(cè)受檢者血漿中miR-155的水平 從-80 ℃樣本庫(kù)中取出血漿樣本，采用miR-cute miRNA提取試劑盒提取總RNA，加入30 μL DEPC處理過的ddH2O溶解RNA并分裝保存。取2 μL用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。取1 μg RNA采用TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，miR-155引物：5′-GTCGTATCCA-GTGCAGGGTCCGAGGTATCGCACTGGATAC-GACCAGACTCC-3′。取2 μL cDNA作為模板，加入正、反向引物序列各0.5 μL后，利用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性1 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性10 s，58.5 ℃延伸40 s，72 ℃退火40 s，共37個(gè)循環(huán)。使用StepOne Software軟件分析數(shù)據(jù)，以2-△△CT表示目的基因的表達(dá)量。miR-155引物：上游引物5′-GCAGTCA-TCCTTCATTCCACC-3′，下游引物5′-GTGCAG-GGTCCGAGGTAT-3′；小分子內(nèi)參U6，上游引物5′-CATTGGGAGTTTCAAATCAGC-3′，下游引物5′-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3′。每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.3血清中免疫細(xì)胞因子的檢測(cè) 采用(雙抗體夾心法)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組受檢者血清中Th1類細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)]和Th2類細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的水平。試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。

1.2.4血清中HBV病毒載量的檢測(cè) 采用PCR熒光探針法檢測(cè)各組受檢者血清中HBV病毒載量。首先采用一步法在血清中加入核酸釋放劑，然后采用HBV核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各受檢者血清中HBV-DNA含量，擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。乙型肝炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于廣州Targene公司。

1.2.5血清甲胎蛋白檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法檢測(cè)PHC患者血清甲胎蛋白水平。試劑盒購(gòu)自上海雅培公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組受檢者血漿中miR-155和血清中相關(guān)免疫細(xì)胞分子水平的比較

各組受檢者血漿中miR-155和血清中IL-12、TFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.252～661.419，P<0.05)，但是各組血清TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組相比，PHC組患者血漿中miR-155水平明顯升高，同時(shí)血清中IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10水平均明顯降低(P<0.05)；與HBV組、CHB組和HBV-LC組患者相比，PHC組患者血漿中miR-155水平明顯升高，血清中IL-12、IFN-γ、IL-6水平明顯降低(P<0.05)；HBV相關(guān)肝疾病的4組患者血清中TNF-α、IL-4和IL-10水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組受檢者血漿中miR-155和血清中相關(guān)免疫細(xì)胞分子水平比較

2.2 PHC組患者血漿中miR-155與血清中相關(guān)免疫細(xì)胞分子水平的相關(guān)性

HBV相關(guān)PHC患者血漿中miR-155的水平與血清中IL-12、IFN-γ水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.595、-0.478，P<0.01)，同時(shí)與血清中IL-4、IL-6、IL-10水平則均呈正相關(guān)(r=0.285～0.548，P<0.01、0.05)。

2.3 PHC組患者血漿中miR-155與HBV-DNA載量的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，PHC組患者血漿中miR-155水平與HBV-DNA載量呈正相關(guān)性(r=0.714，P<0.01)。

2.4 PHC組患者血漿中miR-155水平與血清中甲胎蛋白水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，PHC組患者血漿中miR-155水平與血清中甲胎蛋白水平呈正相關(guān)性(r=0.656，P<0.01)。

2.5 血漿中miR-155水平和PHC組患者臨床特征的關(guān)系

血漿中miR-155水平與PHC患者性別、年齡、腫瘤是否微血管侵犯無關(guān)(P>0.05)，然而肝功能Child-Pugh分級(jí)C級(jí)患者血漿中miR-155水平高于A～B級(jí)患者(t=3.218，P<0.01)，腫瘤BCLC分期C～D期患者血漿中miR-155水平高于A～B期患者(t=3.455，P<0.05)，同時(shí)腫瘤直徑>5 cm患者血漿中miR-155水平顯著高于直徑≤5 cm患者(t=5.187,P<0.01)。見表2。

表2 血漿中miR-155水平和PHC組患者其他病理特征的關(guān)系

2.6 血漿中miR-155對(duì)HBV相關(guān)性PHC的診斷價(jià)值

ROC曲線分析顯示，血漿中miR-155對(duì)HBV相關(guān)性PHC診斷的靈敏度為94.5%，特異度為68.5%，AUC為0.892(95%CI=0.810～0.942)。見圖1。

圖1 血漿中miR-155診斷HBV相關(guān)性PHC的ROC曲線圖

3 討 論

眾多研究證實(shí)，HBV活躍復(fù)制是肝炎肝硬化和PHC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7-8]，但是其潛在的HBV導(dǎo)向致癌的分子機(jī)制尚存在巨大的爭(zhēng)議。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)展，miRNAs組學(xué)分析對(duì)于推動(dòng)PHC臨床精準(zhǔn)醫(yī)療提供新的研究思路。

慢性HBV感染的自然過程可分為三個(gè)階段：免疫耐受期、免疫清除期和殘留期或非活動(dòng)期，然而其中確切的相關(guān)機(jī)制仍不清楚。miRNAs是一類小的非編碼RNA，大約有22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，參與先天性以及后天性免疫應(yīng)答。幾乎所有的DNA病毒包括HBV，都具有自己獨(dú)特的miRNA體系[9]。但由于通過計(jì)算機(jī)模擬手段，并未獲得與3′端人類基因組相匹配的HBV編碼miRNA[10]，因此HBV編碼的miRNA是否具有致癌功能尚存有爭(zhēng)議，而眾多研究卻證實(shí)，HBV產(chǎn)物可影響宿主細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜，包括某些具有促癌或抑癌活性的miRNAs，進(jìn)而參與宿主細(xì)胞的惡性癌變過程[11-13]。HBV尤其是乙肝病毒X蛋白(HBx)通過上調(diào)宿主細(xì)胞miR-155表達(dá)，進(jìn)而抑制抑癌基因ZHX2，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，HBx是肝癌中主要的HBV蛋白之一，可激活癌基因，導(dǎo)致表觀遺傳修飾，調(diào)控非編碼RNA的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、代謝、轉(zhuǎn)移等[14]。因此基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，推斷miR-155水平明顯升高可能是HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌進(jìn)展的重要因素，而且本研究也證實(shí)，PHC患者肝功能越差、腫瘤分化程度越高、腫瘤直徑越大，血漿中miR-155表達(dá)水平越高。miR-155是PHC發(fā)生過程中重要的致癌基因，如FU等[15]證實(shí)，miR-155通過靶向PTEN基因激活PI3K/AKT通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞體內(nèi)和體外增殖。本研究結(jié)果亦顯示，HBV相關(guān)性肝疾病患者血漿中miR-155表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，提示miR-155在HBV相關(guān)性肝疾病中屬于功能性基因，這與上述基礎(chǔ)研究結(jié)論基本一致；而且在PHC患者中，隨著HBV-DNA載量增加，血漿中miR-155表達(dá)量也相應(yīng)上升，說明兩者存在一定的調(diào)控關(guān)系，miR-155表達(dá)量在一定程度上可反應(yīng)HBV病毒復(fù)制程度。

此外，HBV持續(xù)感染狀態(tài)導(dǎo)致PHC的發(fā)生過程是一個(gè)多因素參與，涉及多種機(jī)制的復(fù)雜過程[16]，與宿主的免疫功能也密切相關(guān)，包括CD4+T細(xì)胞亞群功能紊亂[17]、細(xì)胞因子的分泌[18]以及某些特異信號(hào)通路的轉(zhuǎn)變[19]等。如CD4+T細(xì)胞亞群可進(jìn)一步分化為Th1和Th2，分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答[20-22]。本研究顯示，在HBV相關(guān)性肝疾病患者體內(nèi)Th1/Th2平衡逐漸發(fā)生偏移，雖然Th1類細(xì)胞因子(IL-12、INF-γ)和Th2類細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)表達(dá)量較對(duì)照組均顯著降低，但是Th1類細(xì)胞因子(IL-12、INF-γ)表達(dá)水平降低更明顯，說明HBV相關(guān)性肝疾病患者體內(nèi)細(xì)胞免疫和體液免疫功能均受到不同程度抑制，尤其是PHC患者，Th1型細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯降低，而Th2型細(xì)胞因子則占據(jù)相對(duì)優(yōu)勢(shì)。而且PHC患者體內(nèi)miR-155水平與Th1類細(xì)胞因子(IL-12、INF-γ)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，但是與Th2類細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)表達(dá)量則呈正相關(guān)性，說明miR-155可誘導(dǎo)Th1/Th2平衡向Th2型偏移，Th1細(xì)胞減少，細(xì)胞因子IFN-γ則分泌減少，對(duì)Th0分化為Th2細(xì)胞的抑制作用減弱，Th2細(xì)胞增加，細(xì)胞免疫功能下降，從而形成宿主對(duì)HBV抗原的免疫耐受，導(dǎo)致HBV持續(xù)感染，并向HBV-LC和PHC方向演變。

我國(guó)是HBV感染以及肝癌的高發(fā)病國(guó)家之一[23]，根據(jù)中國(guó)疾病防治中心預(yù)估的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)的HBsAg攜帶率約為5%～6%，而約85%的PHC患者攜帶HBV感染標(biāo)志物[24]。雖然我國(guó)乙肝疫苗接種已基本實(shí)現(xiàn)全國(guó)范圍普及，但是仍有部分兒童(16.89%～35.07%)在完成初次三針全接種后出現(xiàn)無應(yīng)答或低應(yīng)答情況[25]，因此加強(qiáng)HBV預(yù)防和PHC早期篩查工作一直是公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)[26]。甲胎蛋白是早期篩查和診斷PHC最常使用的血清腫瘤學(xué)指標(biāo)[27]，其檢測(cè)特異度高，但是仍有30%～40%的肝癌患者呈陰性[28-30]，因此尋找新的血清腫瘤學(xué)分子勢(shì)在必行。本研究結(jié)果顯示，血漿中miR-155對(duì)于HBV相關(guān)性PHC的診斷靈敏度和特異度較高，說明miR-155在PHC的診斷和精準(zhǔn)治療方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，但是是否能夠?qū)崿F(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，miR-155在HBV相關(guān)性PHC患者血漿中表達(dá)量升高，并且與HBV-DNA載量、Th1/Th2免疫失衡密切相關(guān)，可為該類患者臨床早期診斷和篩查提供一定的參考作用。