卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域蛋白3敲除小鼠黑質(zhì)區(qū)核因子κB相關(guān)炎癥因子表達(dá)的變化及其機(jī)制

高藝峻 賈鳳菊 焦倩 陳曦 杜希恂 姜宏

(青島大學(xué)國家生理學(xué)重點(diǎn)(培育)學(xué)科，山東 青島 266071)

卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域蛋白3(OTUD3)是去泛素化酶(DUBs)家族OTU亞家族中的一個成員，位于人類染色體1p36.13[1-2]。OTUD3不僅被證實(shí)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-5]，還可以通過抑制線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)Lys63位的多聚泛素化，進(jìn)一步抑制MAVS的聚集，切斷視黃酸誘導(dǎo)基因1(RIG-1)樣受體(RLR)信號通路上的先天抗病毒免疫應(yīng)答，從而限制了先天抗病毒免疫信號的傳導(dǎo)[6-7]。為了更加全面地了解OTUD3對先天免疫應(yīng)答中核因子κB(NF-κB)相關(guān)炎癥因子的影響，本研究選用24月齡OTUD3敲除(OTUD3-/-)雄性小鼠及其同窩野生型(WT)雄性小鼠各3只，對6只小鼠的中腦黑質(zhì)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序(RNA-seq)分析，篩選出差異表達(dá)基因(DEGs)，并通過KEGG通路富集分析可能參與先天免疫和神經(jīng)炎癥相關(guān)的信號通路，同時采用實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)對篩選出的DEGs進(jìn)行mRNA水平的驗(yàn)證，旨在探討OTUD3對NF-κB相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響，以及OTUD3參與調(diào)控神經(jīng)炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

24月齡OTUD3-/-雄性小鼠3只，同窩WT雄性小鼠3只，體質(zhì)量(30±2)g，均由中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所、國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心(北京)提供。實(shí)驗(yàn)動物分為WT組與OTUD3-/-組，小鼠在室溫(23±1)℃，濕度(50±10)%，12/12 h晝夜循環(huán)光照條件下飼養(yǎng)，并自由飲水、進(jìn)食。所有動物的處理均遵循醫(yī)學(xué)倫理及原則，倫理編號：201810OTUD3-/-3WT32019-03012。

1.2 儀器與試劑

水合氯醛、三氯甲烷(美國Sigma公司)，TRIzol Reagent(美國Thermo fisher Scientific公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11711,湖南艾科瑞生物工程有限公司)，qPCR試劑盒(AG11701,湖南艾科瑞生物工程有限公司)，S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司)，CFX96TMReal-Time System(美國BIO-RAD公司)。

1.3 小鼠黑質(zhì)組織的收集及RNA-seq分析

腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠后，迅速斷頭取腦，在冰上取出雙側(cè)黑質(zhì)組織，并置于液氮罐中保存。測序樣本使用干冰進(jìn)行保存并送至深圳華大基因股份有限公司(以下簡稱華大基因)進(jìn)行RNA-seq相關(guān)分析。

1.4 小鼠黑質(zhì)RNA的提取

將取材后的WT小鼠和OTUD3-/-小鼠的黑質(zhì)組織置于EP管中，加入TRIzol Reagent 500 μL，使用電動研磨棒研磨組織；勻漿化的樣品室溫溫育5 min，使核蛋白復(fù)合物完全解離后，加入三氯甲烷150 μL，劇烈甩動離心管15 s，使其充分混勻，室溫溫育5 min；再于4 ℃下不超過12 000 r/min離心15 min；離心后混合物分為3相，RNA位于上層水相；將水相轉(zhuǎn)移至新的離心管當(dāng)中，加入異丙醇250 μL，沉淀RNA；室溫溫育10 min后，4 ℃下不超過12 000 r/min離心10 min；去上清液，加入體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇溶液500 μL；渦旋振蕩器處理樣品，4 ℃下不超過7 000 r/min離心5 min；稍微晾干RNA，加入無酶無菌水10 μL使其全部溶解。

1.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小鼠黑質(zhì)DEGs

將提純的RNA置于65 ℃的水浴條件下變性5 min，立即置于冰上。首先將gDNA Clean Reagent 1 μL，5×gDNA Clean Buffer 2 μL，總RNA 1 μg，后加入無酶無菌水至10 μL配成反應(yīng)體系，42 ℃下反應(yīng) 2 min，4 ℃下恒溫維持以去除基因組DNA。再將上述反應(yīng)液10 μL加入Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×RTase Reaction Buffer Mix I 4 μL，加入無酶無菌水至20 μL配成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，37 ℃下反應(yīng)15 min，85 ℃下反應(yīng) 5 s，后4 ℃下恒溫維持完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。最后按照qPCR試劑盒說明書要求配制qPCR反應(yīng)體系20 μL：2×SYBR?Green Pro Taq HS Premix 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，加入無酶無菌水至20 μL。上機(jī)反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性30 s；然后95 ℃擴(kuò)增5 s，60 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)；最后65 ℃退火15 s終止擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列由湖南艾科瑞生物工程有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成。GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，LBP上游引物序列：5′-TCTCCAGACTCTGCCAGTCAC-3′，LBP下游引物序列：5′-CAACTGGAGAGCGG-TGATTCC-3′，COX2上游引物序列：5′-CTGGA-ACATGGACTCACTCAGTTTG-3′，COX2下游引物序列：5′-AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3′。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

6只小鼠的測序錯誤率均低于1%，Clean reads的堿基含量均小于50，Q30約為91%，OTUD3-/-組與WT組間基因表達(dá)量的Pearson相關(guān)系數(shù)均大于0.86，數(shù)據(jù)的可靠性高，基因的相似性高，可進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 DEGs表達(dá)分析

OTUD3-/-組和WT組間共有274個DEGs，其中75個基因在WT組呈現(xiàn)高表達(dá)，199個基因在OTUD3-/-組呈現(xiàn)高表達(dá)。

2.3 KEGG通路富集分析

分析結(jié)果顯示，有4個DEGs富集到NF-κB通路上，其中脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)、環(huán)氧合酶2(COX2)、C-C基序趨化因子19(CCL19)和細(xì)胞黏附因子1(ICAM1)的log2(OTUD3-/-/WT)值分別為2.13、1.42、3.50和1.07，與WT組相比，差異均具有顯著性(P<0.05)。2個基因富集在NF-κB的經(jīng)典通路上，分別為LBP和COX2，2個基因富集在NF-κB的非經(jīng)典通路上，為CCL19和ICAM1。

2.4 DEGs mRNA水平的驗(yàn)證

結(jié)果顯示，WT組LBPmRNA水平為0.67±0.05，OTUD3-/-組為2.70±0.22，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.81,P<0.05)；WT組COX2 mRNA表達(dá)水平為1.00±0.02，OTUD3-/-組為1.15±0.04，組間比較差異具有顯著意義(t=3.11,P<0.05)。

3 討 論

OTUD3是DUBs中第二大家族OTU家族成員之一，含有398個氨基酸，主要是由OTU結(jié)構(gòu)域和UBA結(jié)構(gòu)域組成，具有典型的半胱氨酸酶活性中心[1-2,7]。在人類基因組中約有100個活躍的DUBs參與疾病代謝過程，包括神經(jīng)變性、炎癥、感染和癌癥等[10]。2003年，AMERIK等[11]在果蠅卵巢組織中首次發(fā)現(xiàn)了OTUD3。目前，國內(nèi)外關(guān)于OTUD3功能的報道局限于OTUD3作為DUB的作用，如參與結(jié)腸癌[12]、乳腺癌[4]、肺癌[5]等癌癥的發(fā)生等。此外，ZHANG等[6]發(fā)現(xiàn)當(dāng)機(jī)體遭受外源性病毒感染時，OTUD3可以調(diào)控機(jī)體的先天抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)。OTUD3-/-小鼠黑質(zhì)NF-κB經(jīng)典通路上的IKKε被激活，導(dǎo)致IKKε的上游信號銜接蛋白促炎癥細(xì)胞因子(TNF)受體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[6,13-15]，進(jìn)而促使IKKε下游信號蛋白IκBα發(fā)生磷酸化和泛素化降解，NF-κB被激活并進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[16-18]。因此，IκBα的降解可以一定程度促使NF-κB激活。而在非經(jīng)典通路上NF-κB主要通過調(diào)控p100、p52進(jìn)入細(xì)胞核，p100是IκB蛋白的另一種形式，NF-κB可與p52形成二聚體穿過核膜進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)NF-κB下游炎癥因子的表達(dá)[19]。機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)可以通過非特異性的方式抵御外來感染，NF-κB是調(diào)控這種復(fù)雜反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一[20]。

本研究RNA-seq結(jié)果顯示，與NF-κB相關(guān)的4個炎癥因子表達(dá)顯著上調(diào)，經(jīng)典通路上游因子LBP表達(dá)升高，下游炎癥因子COX2表達(dá)升高，非經(jīng)典通路的下游因子CCL19、ICAM1表達(dá)升高。其中，PARK等[21]發(fā)現(xiàn)LBP與脂多糖(LPS)具有高度親和性，參與LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。XUE等[22]發(fā)現(xiàn)COX2可通過前列腺素和細(xì)胞因子的協(xié)同作用被誘導(dǎo)激活，通常在慢性炎癥組織中高表達(dá)[23]。根據(jù)本研究結(jié)果，OTUD3-/-小鼠黑質(zhì)LBP表達(dá)上調(diào)，這可能會加速細(xì)胞中IκBα蛋白的降解，促使NF-κB與其解離并進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致下游相關(guān)炎癥因子COX2表達(dá)也上調(diào)，使得經(jīng)典通路上NF-κB與p65/p50二聚體解離而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致下游的炎癥因子表達(dá)升高。因此，LBP的表達(dá)上調(diào)可能是由于OTUD3-/-后，造成小鼠黑質(zhì)NF-κB下游炎癥因子表達(dá)上調(diào)的原因之一。

NF-κB非經(jīng)典通路下游的炎癥因子ICAM1在炎癥過程中介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，是神經(jīng)細(xì)胞中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶等過程的重要因子[24-25]。CCL19廣泛參與慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，且持續(xù)的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)[26-29]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，OTUD3-/-小鼠黑質(zhì)ICAM1、CCL19的表達(dá)上調(diào)，表明NF-κB非經(jīng)典通路被激活，參與了神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[30]。因此，OTUD3-/-小鼠黑質(zhì)缺失OTUD3，會導(dǎo)致NF-κB下游炎癥因子COX2、ICAM1以及CCL19的表達(dá)上調(diào)。

盡管本研究觀察到OTUD3參與調(diào)控NF-κB相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，并明確了OTUD3-/-小鼠黑質(zhì)中LBP和COX2 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，但其具體機(jī)制以及在神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)中的作用還需進(jìn)一步探討。