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    上海進口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌耐藥性、毒力基因和遺傳特征

    2021-05-19 07:05:44申進玲趙麗娜許鎮(zhèn)堅楊捷琳郭德華
    食品科學 2021年8期
    關鍵詞:溶血性弧菌水產(chǎn)品

    申進玲,趙麗娜,*,韓 偉,許鎮(zhèn)堅,蔣 原,,*,楊捷琳,郭德華,薛 峰

    (1.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心,上海 200135;2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210095)

    副溶血性弧菌是全球范圍內(nèi)引起水產(chǎn)類食物中毒的首要病原菌,尤其在中國、日本在內(nèi)的亞洲國家和美國等地區(qū)。副溶血性弧菌在美國每年引起約8萬 例疾病以及100 人死亡[1],中國臺灣、日本和東南亞近50%的食物中毒事件是由副溶血性弧菌引起[2]。副溶血性弧菌可在水生動物的腸道內(nèi)黏附、聚集和繁殖,引發(fā)水生動物疾病,給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失,亦可引起人類胃腸炎等疾病,嚴重者可引發(fā)傷口感染和敗血癥等[3]。溶血素是副溶血性弧菌最主要致病因子,包括不耐熱溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)、直接耐熱溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)和TDH相關溶血素(TDH related hemolysin,TRH),分別由tlh、tdh和trh基因編碼。TLH在副溶血性弧菌中高度保守,TDH具有細胞毒性、致死毒性和腸毒性,而TRH具有腸毒性,致病性副溶血性弧菌通常攜帶TDH和TRH中的1 種或2 種。近年來隨著抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的濫用,細菌耐藥性問題更加劇了副溶血性弧菌的風險。上??诎哆M口水產(chǎn)品數(shù)量居全國第一,且樣品來自各個國家地區(qū),種類豐富,代表性強。上海及其周邊沿海一帶對水產(chǎn)品的消費量逐年遞增。進口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的存在對我國食品安全和公共衛(wèi)生帶來極大威脅。研究我國進口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的分布情況、耐藥性、毒力基因和遺傳多樣性,對保障我國人民生命安全和健康具有重大意義。因此本研究擬對不同國家進口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌進行耐藥、關鍵毒力基因和多位點序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)分析,旨在為進口食品風險科學預警和溯源提供數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株

    本研究所用68 株副溶血性弧菌菌株由2017—2019年上??诎哆M口的400 份水產(chǎn)品中分離,樣品來自全世界16 個國家(地區(qū)),樣品種類涵蓋魚、蝦、貝、蟹等常見海產(chǎn)品和淡水產(chǎn)品等(表1)。所有菌株經(jīng)生化和分子生物學鑒定確證為副溶血性弧菌。

    表1 副溶血性弧菌菌株來源信息Table 1 Information about the sources of Vibrio parahaemolyticus isolates

    藥敏實驗所用質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌標準菌株ATCC25922。分子生物學鑒定所用菌株為副溶血性弧菌標準菌株ATCC33847(tdh+)和ATCC17802(trh+)。所用質(zhì)控菌株均為本實驗室保存。

    1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

    弧菌顯色培養(yǎng)基 法國科瑪嘉公司;3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂 北京陸橋技術股份有限公司;Mueller-Hinton瓊脂、藥敏紙片 英國Oxoid公司;實時聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)預混液、PCR預混液、DNA Marker DL2000 寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司。引物探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2 儀器與設備

    Vitek全自動微生物生化鑒定儀(梅里埃)、ABI7500 fast實時熒光PCR儀 美國Applied Biosystems公司;5415R離心機 德國Eppendorf公司;ND-1000分光光度計 美國Nano-Drop科技公司;電泳槽、電泳儀美國Bio-Rad公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌株純化與鑒定

    使用無菌接種環(huán),將菌株劃線接種至副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過夜,挑取紫色單菌落,再次劃線接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂上培養(yǎng)過夜。用一次性無菌接種環(huán)挑選適量菌落于3 mL無菌生理鹽水中充分混勻,制成麥氏濁度為0.5的菌懸液,使用全自動微生物生化鑒定儀進行鑒定。

    1.3.2 DNA模板制備

    DNA制備方法采用煮沸裂解法。用無菌槍頭吸取500 μL 1.3.1節(jié)菌懸液于1.5 mL離心管中,100 ℃煮沸15 min后,冷卻至室溫,12 000×g離心2 min,取上清液備用。對符合生化實驗的菌株采用PCR方法擴增副溶血性弧菌特異的tlh基因[4]。

    1.3.3 藥敏實驗

    采用WHO推薦的紙片擴散法。共測試對8 類15 種抗生素的耐藥性。包括青霉素類:氨芐西林(ampicillin,AMP)、阿莫西林(amoxicillin,AMC)、哌拉西林(piperacillin,PRL);青霉烯類:美羅培南(meropenem,MEM)、亞胺培南(imipenem,IPM);頭孢類:頭孢他啶(ceftazidime,CAZ)(第3代)、頭孢噻肟(cefotaxime,CTX)(第3代)、頭孢西丁(cefoxitin,F(xiàn)OX)(第2代);氨基糖苷類:阿米卡星(amikacin,AK)、慶大霉素(gentamicin,CN);氟喹諾酮類:環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)、左氧氟沙星(levofloxacin,LEV);氯霉素類:氯霉素(chloramphenicol,C);四環(huán)素類:四環(huán)素(tetracycline,TE);磺胺類:磺胺新諾明(sulfamethoxazole,SXT)。依據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會的標準判定藥敏結(jié)果[5]。以大腸埃希菌標準菌株ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

    1.3.4 毒力基因檢測

    副溶血性弧菌關鍵毒力基因tdh和trh檢測所用引物探針、real-time PCR體系和條件按照文獻報道進行[4,6]。

    1.3.5 MLST分析

    表2 副溶血性弧菌MLST PCR擴增和測序引物信息Table 2 Amplification and sequencing primers used in multi-locus sequence typing analysis of V. parahaemolyticus isolates

    副溶血性弧菌的7 個管家基因recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC、tnaA引物、PCR體系和反應條件參考網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/vparahaemolyticus/info/protocol.shtml),PCR擴增和測序引物序列見表2。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。采用Bioedit軟件對分離株的每段基因序列與從MLST網(wǎng)站下載的參考菌株序列進行比對,將分離株的基因序列剪切后得到與參考菌株基因相同大小的片段。將經(jīng)過剪切的每株菌的7 個基因序列按照相同的順序首尾相接,得到3 961 bp的長片段。將所有菌株的3 961 bp片段導入至MEGA 6.06軟件,采用UPGMA方法生成系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 耐藥結(jié)果分析

    表3 68 株副溶血性弧菌藥敏實驗結(jié)果Table 3 Antimicrobial resistance of 68 V. parahaemolyticus isolates

    如表3所示,68 株菌株對LEV和C均敏感,對其余抗生素不同程度地耐藥,耐藥率最高的是AMP,達98.53%,其次是AK(8.82%)、CN(5.88%)、PRL(5.88%)、MEM(4.41%)、SXT(4.41%)。對AMC、IPM、CAZ、FOX的耐藥率較低,均為1.47%。同時,對9 種抗生素中介耐藥,其中氨基糖苷類抗生素中介耐藥率最高,分別達45.59%(AK)、36.76%(CN)。其他中介耐藥率較高的抗生素依次為29.41%(PRL)、20.59%(CIP)、10.29%(FOX),其余抗生素中介耐藥率相對較低(1%~3%)。不同地區(qū)和產(chǎn)品來源的菌株耐藥情況未發(fā)現(xiàn)有明顯差異。

    如表4可知,79.41%的菌株表現(xiàn)出單一耐藥,AMP是主要的耐藥譜,耐受2 種及以上的菌株占20.59%,其中耐受2 種抗生素的耐藥譜較分散,占比14.71%,有4 株耐3 種及以上抗生素,耐藥譜分別為AMP-AK-CN(加拿大鰲蝦F21),AMP-AK-CN-PRL(美國珍寶蟹F14、孟加拉黑蟹F43),AMP-CAZ-SXT-FOX-AMC-PRL-MEM(愛爾蘭面包蟹F64),同時它們也均表現(xiàn)出對2 種抗生素的中介耐藥。38.24%表現(xiàn)為單一中介耐譜,對2 種抗生素中介耐藥的占25.00%,14.71%的菌株表現(xiàn)對3 種及以上的抗生素中介耐藥。

    表4 68 株副溶血性弧菌耐藥譜和中介譜分布Table 4 Resistance and intermediate resistance spectrum distribution of 68 V. parahaemolyticus isolates

    2.2 毒力基因檢測結(jié)果

    所有副溶血性弧菌均為tlh陽性。只有來自印度黑蟹的1 株菌株(F108,未知ST型)檢出trh陽性,其余均為陰性,檢出率為1.47%(1/68)。所有菌株tdh檢測結(jié)果為陰性。

    2.3 MLST分析

    MLST分析結(jié)果顯示所測試的菌株具有高度遺傳多樣性。68 株菌株共發(fā)現(xiàn)65 種ST型,經(jīng)與pubMLST數(shù)據(jù)庫比較,只有13 種是已知報道的ST型,分別是ST163、ST423、ST150、ST338、ST340、ST744、ST500、ST2192、ST490、ST338、ST154、ST12、ST424。其余52 種ST型是新發(fā)現(xiàn)的,新ST型高達80%。52 種新發(fā)現(xiàn)的ST型中,35 株由于一個或多個位點基因突變,不能與pubMLST數(shù)據(jù)庫完全匹配。

    圖1 不同國家不同食品類型來源副溶血性弧菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of V. parahaemolytics isolates from various types of food imported from different countries

    除了2 株recA不能擴增,其余66 株的親緣關系見圖1。副溶血性弧菌高度多樣化,分別來自菲律賓和印度尼西亞青蟹中的2 株與其他菌株親緣關系較遠。剩余的菌株中,除了越南草蝦中1 株(CXF3)和加拿大珍寶蟹1 株(F62),其余菌株可以分為2 簇:Ia和Ib。5 株歐洲(愛爾蘭、荷蘭、英國)來源的菌株中,4 株位于Ib;5 株來自莫桑比克青蟹的菌株中4 株位于Ia。未發(fā)現(xiàn)其他國家(地區(qū))來源的菌株明顯的聚類,如加拿大和美國珍寶蟹、越南草蝦、印度尼西亞和菲律賓的青蟹、印度黑蟹分布均較分散。但發(fā)現(xiàn)某些從同一地區(qū)不同時間點進境的相同食品類型中的菌株ST型一致或非常接近,且這些ST型未在其他地區(qū)出現(xiàn)。如F103和F134均來自加拿大的珍寶蟹,但時間相隔1 個月,分別在2019年3月20日和4月16日進境,同屬于一個未知的ST型;F58和F121均來自莫桑比克的青蟹,分別于2019年2月25日和4月8日進境,同屬于ST338;F18(ST 163)和F79分別來自2018年12月印度尼西亞青蟹和2019年3月馬來西亞青蟹,ST型只存在1 個堿基差異。

    3 討論和結(jié)論

    弧菌一般對人用和獸用的抗生素敏感,但隨著抗生素在人類、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)系統(tǒng)的濫用,副溶血性弧菌也表現(xiàn)出對多種抗生素的耐藥。據(jù)文獻報道,副溶血性弧菌對AMP具有較高的耐藥率,本研究測定的副溶血性弧菌對AMP的耐藥率達98.53%,與國內(nèi)外報道一致[7-10]。Elmahdi等[11]通過分析不同國家的副溶血性弧菌耐藥譜,發(fā)現(xiàn)最常耐藥的抗生素為AMP、盤尼西林和TE。本研究尚未發(fā)現(xiàn)TE耐藥,但發(fā)現(xiàn)近3%菌株對TE中介耐藥。值得注意的是,本研究菌株表現(xiàn)出對多種抗生素的中介耐藥,其中氨基糖苷類抗生素中介耐藥情況最突出,另外PRL、CIP和FOX中介耐藥率也達到10%~30%,與國內(nèi)外報道一致[7,12-17]。中介耐藥說明菌株正在適應抗生素,需要引起重視。據(jù)報道,近年來副溶血性弧菌逐漸出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象[15,18-20],本研究也發(fā)現(xiàn)上??诎哆M口水產(chǎn)品中20.59%的菌株表現(xiàn)出對2 種及以上的抗生素耐藥。值得注意的是,深海水產(chǎn)品中副溶血性弧菌也發(fā)現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象,說明抗生素耐藥已經(jīng)延伸到深海區(qū)域,今后應重點關注深海水產(chǎn)品中致病菌的耐藥情況。

    分子流行病學表明攜帶tdh和trh基因的副溶血性弧菌產(chǎn)毒株與人類食源性疾病的爆發(fā)密切相關,它們在臨床菌株中檢出率高,而在環(huán)境和食品中檢出率很低[2,4,21]。于紀棉等[12]報道寧波口岸進口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的tdh和trh攜帶率分別為0.78%和0%,陳廣全等[22]報道北京口岸進口鮮活海產(chǎn)品中副溶血性弧菌tdh和trh攜帶率均為5%,李薇薇等[23]報道我國國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)18 個省、自治區(qū)、直轄市水產(chǎn)品中副溶血性弧菌tdh和trh攜帶率分別為0%和2.08%,白瑤等[8]報道我國26 個省、直轄市和自治區(qū)水產(chǎn)品中分離的1 137 株副溶血性弧菌中tdh和trh檢出率分別為0.3%和1.7%。本研究也發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌trh和tdh攜帶率極低,與以往報道相符[7,24-25]。因此,國內(nèi)市場和進口水產(chǎn)品中均存在致病性副溶血性弧菌,對我國人民健康帶來隱患,日后需要加強監(jiān)測。

    本研究測試的水產(chǎn)品中副溶血性弧菌菌株呈現(xiàn)高度的遺傳多樣性,與以往研究結(jié)果一致[26-28]。經(jīng)pubMLST數(shù)據(jù)庫查詢,本研究發(fā)現(xiàn)的ST型中,ST338、ST340、ST774均在臨床中報道過,因此這些菌株可能具有致病風險。65 種發(fā)現(xiàn)的ST型中,新發(fā)現(xiàn)的有52 種。新型如此之多,可能是由于副溶血性弧菌基因組通過突變和重組一直在改變[26,29]。有研究表明,副溶血性弧菌基因組高度重組,被稱為半克?。╯emi clonal)群體[30]。由于基因和基因簇在親緣關系較遠或較近的菌株間傳播,因此基于MLST的分型分析較難找到與地域或食品類型高度相關的克隆株[8,17,26]。白瑤等[8]對我國水產(chǎn)品中20 株tdh和(或)trh陽性的副溶血性弧菌PFGE分析結(jié)果也顯示,PFGE型別與耐藥譜、地域來源以及食品類別均無明顯關系,但來自河北省的5 株同源性較高。Urmersbach等[26]對來自斯里蘭卡、厄瓜多爾、北海、波羅的海和德國環(huán)境和水產(chǎn)品中副溶血性弧菌MLST分析,也未發(fā)現(xiàn)ST型與地域之間有明顯關系。本研究基于MLST分析的系統(tǒng)發(fā)育樹圖顯示,國家(地區(qū))、食品類別與MLST型和耐藥性并無明顯相關性,但發(fā)現(xiàn)某些地區(qū)來源的菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹圖上呈現(xiàn)局部聚集,另外也發(fā)現(xiàn)某些ST型分別在相隔數(shù)月的時間在來自于同一國家同一食品中出現(xiàn)。這說明,在這些國家可能出現(xiàn)了新的流行克隆株,同時也說明MLST分析在副溶血性弧菌流行病學研究中可以監(jiān)測并跟蹤新的流行克隆,實現(xiàn)早期預警。

    有研究報道recA基因存在重組導致的大量位點突變,因此有學者提出recA不是MLST中的理想位點[31]。本研究也發(fā)現(xiàn)在68 株菌株的7 個基因中,recA基因差異性最大,與pubMLST數(shù)據(jù)庫相比,2 株具有多個位點突變,其他基因突變位點一般為1 個(結(jié)果未顯示),另外還有2 株經(jīng)過多次PCR未能擴增成功。已有不少報道證實,recA擴增不成功是有大片段插入recA基因位點所致,這種插入可對菌株的生物特性產(chǎn)生影響[32-33]。González-Escalona等[32]發(fā)現(xiàn)來自弧菌屬的長片段插入秘魯糞便樣品中分離的副溶血性弧菌O4∶K8(菌株編號090-96)的recA中,后經(jīng)對原始recA基因重建分析發(fā)現(xiàn),其祖先為僅在亞洲出現(xiàn)的ST189,證實了菌株的跨海洋傳播。Chen xiao等[33]在O4∶KUT中發(fā)現(xiàn)與菌株090-96同樣的插入片段,基因組分析提示該菌株從O4∶K8進化而來,但插入片段的功能以及與K抗原之間的關系尚未可知。因此未來將對本研究中recA擴增不正常的菌株進行全基因組測序,以揭示插入片段在菌株進化中的作用。

    綜上所述,通過對上海口岸進口水產(chǎn)品中副溶血性弧菌進行耐藥性、毒力基因和MLST分析,發(fā)現(xiàn)菌株存在中介耐藥和多重耐藥現(xiàn)象,尤其在深海水產(chǎn)品中也出現(xiàn)了多重耐藥;發(fā)現(xiàn)某些ST型在臨床中報道過,篩選到攜帶毒力基因的高致病性菌株,這些均具有高風險;發(fā)現(xiàn)某些國家可能存在新的流行克隆。這些均需要引起重視,并在今后工作中持續(xù)加強監(jiān)測,以期為我國進口食品風險因子科學預警和溯源提供數(shù)據(jù)和技術支撐。

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