盤縣火腿深度腐敗的微生物及揮發(fā)性風(fēng)味化合物表征

母 雨，蘇 偉,*，母應(yīng)春

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

干腌火腿是一種傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，有數(shù)千年的消費(fèi)歷史。已經(jīng)證明干腌火腿富含多種營養(yǎng)物質(zhì)并具有潛在健康益處[1-2]。盤縣火腿是我國著名干腌火腿之一，于2012年獲得“國家地理標(biāo)志”稱號[3]。它的加工工藝包括鮮腿老化、腌制、堆碼翻壓、靜置和成熟，周期長達(dá)12～24 個(gè)月，長時(shí)間的成熟和獨(dú)特的地理環(huán)境賦予其鮮明的品質(zhì)特征。然而，盤縣火腿的生產(chǎn)采用自然發(fā)酵，且不使用任何防腐劑，其穩(wěn)定性完全依賴于鹽的滲透和成熟過程的脫水。因此，一些腐敗微生物很可能在加工早期生長繁殖，并最終導(dǎo)致產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)。

干腌火腿的變質(zhì)是一個(gè)長期性、世界性的難題。據(jù)報(bào)道，西班牙每年有大約3 000萬 只火腿腐敗變質(zhì)，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千萬美元[4]。干腌火腿常見的腐敗類型有“深度腐敗”和“靜脈缺陷”。其中，“深度腐敗”是最重要的一種變質(zhì)類型，其特征是糊狀質(zhì)地和令人討厭的臭味，這種臭味常見于鄰近骨骼結(jié)構(gòu)的大塊肌肉中[5]。研究認(rèn)為這種類型的腐敗是由微生物菌群，特別是細(xì)菌造成的，且已基于培養(yǎng)法分離出相應(yīng)菌株[6]?！办o脈缺陷”屬于表層腐敗，腐敗區(qū)域通常具有較高的鹽含量，已從此類腐敗中培養(yǎng)分離出一些嗜鹽菌，如肉桿菌（Carnobacterium）、棒狀桿菌（Corynebacterium）、弧菌（Vibrio）和海生乳桿菌（Marinilactibacillus）[7-8]。然而，由于可存活但不可培養(yǎng)狀態(tài)，培養(yǎng)法僅能分離出完整微生物種群的一部分[9]。相比之下，高通量測序可以對復(fù)雜的微生物群進(jìn)行更深入、更精確的評估，已用于揭示干腌火腿的群落組成[10]。此外，由于“深度腐敗”的主要缺陷在于異味，采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法檢測腐敗火腿的標(biāo)志性風(fēng)味。

本研究旨在表征與盤縣火腿“深度腐敗”有關(guān)的微生物和揮發(fā)性風(fēng)味，其豐度和含量可用作確定盤縣火腿變質(zhì)的指標(biāo)，有助于發(fā)現(xiàn)和控制早期的腐敗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

盤縣火腿樣品（正常和腐敗火腿各3 只）由貴州省盤州市火腿加工廠提供，所有樣品均取自相同工藝、環(huán)境下生產(chǎn)的同一批次火腿。為盡可能減少影響因素，正?；鹜热硬课慌c腐敗火腿一致。取樣完成后立即裝入無菌袋，并置于低溫泡沫盒中12 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室，貯存于-80 ℃直至分析。

Power Soil?DNA提取試劑盒 美國MP Bio公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；DNA聚合酶 大連寶生物工程有限公司；正反引物 深圳市英俊生物技術(shù)有限公司；DNA純化磁珠 南京諾唯贊生物科技有限公司；MinElute?聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒 德國Qiagen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti? 9902 PCR儀 美國ABI公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)、Trace1300-TSQ8000 GC-MS聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Illumina MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)的測定

水分含量測定：利用直接干燥法；鹽含量測定：采用GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測定》方法；水分活度（aw）測定：水分活度儀；pH值測定：pH計(jì)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 高通量測序

1.3.2.1 總DNA提取與PCR擴(kuò)增

每個(gè)樣品在無菌條件下取10 g并充分研磨，然后根據(jù)說明書使用Power Soil DNA試劑盒提取樣品總DNA。DNA的質(zhì)量和數(shù)量以O(shè)D260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm的比值進(jìn)行評估。然后將DNA保存在-80 ℃，直到進(jìn)一步處理。利用引物（338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）結(jié)合適配器序列和條形碼序列擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3-V4區(qū)。

PCR擴(kuò)增體系的總量為50 μL，包括10 μL緩沖液、0.2 μL Q5 High-Fidelity DNA聚合酶、10 μL高GC增強(qiáng)劑、1 μL核苷酸、正反引物各10 μmol/L和60 ng的基因組DNA。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共15 個(gè)循環(huán)；72 ℃擴(kuò)展7 min。利用VAHTSTM DNA磁珠純化第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。第2輪PCR擴(kuò)增體系為40 μL，包括20 μL 2×Phusion HF MM、8 μL ddH2O、正反引物各10 μmol/L以及第1輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物10 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 個(gè)循環(huán)；72 ℃擴(kuò)展5 min。利用PCR純化試劑盒對瓊脂糖凝膠回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)定量并按每個(gè)樣本的測序要求進(jìn)行混合，最后使用Illumina HiSeq 2500平臺對純化的混合樣本進(jìn)行細(xì)菌rRNA基因的高通量測序分析。

1.3.2.2 測序數(shù)據(jù)處理

根據(jù)雙端測序之間的overlap關(guān)系，利用FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個(gè)樣品的序列進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始序列數(shù)據(jù)；然后利用Trimmomatic v0.33軟件對拼接后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)；最后，使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)。利用QIIME v1.8.0對有效數(shù)據(jù)在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），并基于Silva分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，設(shè)置比對閾值為70%。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

1.3.3.1 風(fēng)味化合物的提取與檢測

參照Maru?i?等[11]的方法提取和檢測揮發(fā)性風(fēng)味化合物，并略作修改。準(zhǔn)確稱取5.00 g切碎的火腿樣品置于25 mL飽和食鹽水中，均質(zhì)2 min以制備火腿勻漿。取10 mL勻漿置于20 mL頂空瓶中并用PTFE隔膜蓋緊，然后使用已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在40 ℃振搖提取180 min。萃取完成后，立即將SPME纖維插入進(jìn)樣口，在230 ℃解吸5 min。

色譜條件：毛細(xì)管柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，不分流模式。柱升溫程序：50 ℃保持5 min，然后以5 ℃/min的速率升至200 ℃，最后以20 ℃/min的速率升至250 ℃并保持10 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電子能量為70 eV，傳輸線和離子源溫度為280 ℃和230 ℃，掃描范圍m/z50～450，掃描速率為1 scan/s。

1.3.3.2 風(fēng)味化合物的定性與定量

定性：實(shí)驗(yàn)結(jié)果與NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，僅保留正反匹配度均大于800的化合物。在相同的色譜條件下運(yùn)行C6～C30正構(gòu)烷烴混合標(biāo)品，以計(jì)算化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）。計(jì)算公式如下：

式中：Rt（x）、Rt（n）及Rt（n＋1）分別為待測揮發(fā)性成分、含n個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴及（n＋1）個(gè)碳原子正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

定量：峰面積歸一化法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

SPSS Statistics 20.0用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以表示，利用單因素方差分析確定顯著性（P＜0.05）?；讷@得的OTU表格，利用QIIME計(jì)算樣品的α多樣性，包括豐富度指數(shù)（ACE和Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson）。揮發(fā)性風(fēng)味化合物的LEFSe（LDA Effective Size）分析在Galaxy網(wǎng)站上進(jìn)行（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）。環(huán)境因子與細(xì)菌屬之間的冗余分析（redundancy analysis，RDA）基于R v3.6.1軟件的vegan包執(zhí)行?；赑earson相關(guān)系數(shù)（r＞0.7，P＜0.05）建立微生物屬與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)間的相互關(guān)系，并利用Cytoscape v3.2.1軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 物理化學(xué)特性

表1 正常與腐敗盤縣火腿理化特性Table 1 Physicochemical characteristics of normal and spoiled Panxian hams

如表1所示，腐敗火腿的pH值、aw、水分含量顯著高于正常火腿，而NaCl含量顯著低于正?；鹜龋≒＜0.05）。Blanco等[4]在腐敗西班牙火腿中發(fā)現(xiàn)了類似的情況。人工上鹽易導(dǎo)致鹽分布和滲透不均勻，因此低NaCl含量可能與腌制工藝有關(guān)。較高的pH值是產(chǎn)品變質(zhì)的指標(biāo)之一，腐敗火腿中pH值的上升可能與其較低的鹽含量有關(guān)。據(jù)報(bào)道，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～6%即可抑制肌肉組織蛋白酶活力，因此，較低濃度的NaCl導(dǎo)致過度的蛋白水解，從而產(chǎn)生糊狀和升高pH值[12]。另外，pH值越高持水能力越強(qiáng)[13]，這使得腐敗火腿的水分含量高于正?；鹜取w與NaCl含量密切相關(guān)，腐敗火腿中較低的NaCl含量導(dǎo)致較高的aw，Losantos等[14]報(bào)道了aw的下降對腐敗干腌火腿中腸桿菌科微生物的抑制作用。

2.2 細(xì)菌多樣性分析

利用Illumina MiSeq平臺從6 個(gè)樣品中獲得282 148 個(gè)高質(zhì)量16S rRNA序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生47 024.67 個(gè)序列。如表2所示，正常和腐敗火腿在OTU數(shù)目和豐富度指數(shù)上不存在顯著差異（P＞0.05），但在多樣性指數(shù)上存在顯著差異（P＜0.05）。表明腐敗盤縣火腿中存在的細(xì)菌種類可能低于正常火腿。另外，正常和腐敗火腿覆蓋率均為0.999，表明該抽樣方案已經(jīng)基本覆蓋了樣本的細(xì)菌多樣性，數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。

表2 正常與腐敗盤縣火腿的α多樣性分析Table 2 α-Diversity analysis of bacterial communities in normal and spoiled Panxian hams

為進(jìn)一步了解正常和腐敗火腿的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，在門和屬水平上對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分類。在門水平上（圖1A），鑒定出變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。其中，厚壁菌門是正?；鹜戎械膬?yōu)勢菌門，而變形菌門主導(dǎo)腐敗火腿。在屬水平上（圖1B），僅顯示豐度前10的優(yōu)勢微生物，分別為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、norank_Enterobacteriaceae、unclassified_Enterobacteriaceae、鹽單胞菌屬（Halomonas）、沙雷氏菌屬（Serratia）、段桿菌屬（Brevibacterium）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）、涅斯捷連科氏菌屬（Nesterenkonia）、Solitalea和鹽水球菌屬（Salinicoccus）。

圖1 正常和腐敗盤縣火腿在門水平（A）和屬水平（B）上的細(xì)菌群落組成Fig. 1 Bacterial community structures of normal and spoiled Panxian hams at phylum (A) and genus (B) levels

與大多數(shù)干腌火腿一樣[15-16]，葡萄球菌屬是正?；鹜戎凶钬S富的。由于較強(qiáng)的外源酶活力，包括蛋白酶、脂肪酶、過氧化氫酶和硝酸鹽還原酶[17]，凝固酶陰性葡萄球菌被認(rèn)為是肌肉酶之后導(dǎo)致干腌火腿風(fēng)味、顏色和質(zhì)地發(fā)展的重要因素[18]。鹽單胞菌屬是正?；鹜戎械拇我獌?yōu)勢菌，與之前的報(bào)道一致[19]。在腐敗火腿中，腸桿菌科微生物（norank_Enterobacteriaceae、unclassified_Enterobacteriaceae和沙雷氏菌屬）占樣品總豐度的80%以上。腸桿菌科被認(rèn)為是各類腐敗干腌火腿中的優(yōu)勢菌群，特別是沙雷氏菌屬和變形桿菌屬（Proteus）[20-21]。Losantos等[14]從腐敗的塞拉諾和伊比利亞火腿中分離出液化沙雷氏菌（S. liquefaciens）和奇異變形桿菌（P. mirabilis），并認(rèn)為它們的蛋白水解能力可能是臭味形成的原因。類似地，觀察到腸桿菌科微生物與肌鈣蛋白和原肌球蛋白的強(qiáng)烈負(fù)相關(guān)[6]。

2.3 揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

表3顯示正常和腐敗盤縣火腿的揮發(fā)性風(fēng)味組成。共檢出60 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，正?；鹜?9 種，腐敗火腿34 種。其中27 種為正?；鹜泉?dú)有，21 種為腐敗火腿獨(dú)有。按種類將60 種風(fēng)味物質(zhì)分為醛類（23 種）、酮類（13 種）、醇類（6 種）、烴類（6 種）、含苯化合物（6 種）、酸類（2 種）、含硫化合物（2 種）及含氮化合物（2 種）。

表3 正常與腐敗盤縣火腿的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和相對含量Table 3 Types and relative contents of volatile flavor compounds in normal and spoiled Panxian hams

續(xù)表3

為進(jìn)一步篩選正常和腐敗火腿之間的顯著鑒別因子，進(jìn)行LEFSe分析，閾值設(shè)置為LDA＞4，結(jié)果如圖2所示。共鑒定出20 種具有顯著差別的鑒別因子，其中正?；鹜?2 種，腐敗火腿8 種。除酸類和含氮化合物外，其余6大類物質(zhì)在正常和腐敗火腿之間存在顯著差異。正常火腿含有豐富的醛類和醇類，包括壬醛、己醛、十六醛、辛醛、2-十一烯醛、十五醛、(E)-2-癸烯醛、庚醛和1-辛烯-3-醇；而高含量的烴類、酮類、含苯和含硫化合物是腐敗火腿的特征，特別是苯酚、苯乙醛、二甲基二硫醚、1-十五烯和3-甲基丁酸。

圖2 正常與腐敗火腿中的特征揮發(fā)性風(fēng)味化合物Fig. 2 Characteristic volatile flavor compounds in normal and spoiled Panxian hams

醛類物質(zhì)可以由脂質(zhì)氧化和氨基酸的Strecker反應(yīng)產(chǎn)生，對干腌火腿的整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。在正?；鹜戎?，檢測到23 種醛，占風(fēng)味物質(zhì)總面積84.37%，而在腐敗火腿中僅檢出5 種，占總面積的6.05%。正常盤縣火腿中含量較大的醛為壬醛、己醛和十六醛。其中，壬醛和己醛是許多干腌火腿中最豐富的醛類物質(zhì)，其低氣味閾值有助于增加甜味和青草香氣[22]；而具有肉香味的十六醛是巴馬火腿[23]和伊斯特拉火腿[24]的典型特征。相反，腐敗火腿中的酮類物質(zhì)在種類和含量（11 種，14.75%）上均高于正?；鹜龋? 種，1.27%）。García等[25]報(bào)道了類似的結(jié)果，認(rèn)為伊比利亞火腿中酮類物質(zhì)的增加與腐敗微生物的活動(dòng)有關(guān)。另外，酮也可以通過游離脂肪酸的化學(xué)自動(dòng)氧化形成[26]。

醇類物質(zhì)的形成與脂質(zhì)氧化、氨基酸代謝、甲基酮還原和微生物繁殖密切相關(guān)。與之前的報(bào)道不同[27]，醇類物質(zhì)在正?；鹜戎械暮扛哂诟瘮』鹜取４碱愇镔|(zhì)的嗅聞閾值通常比醛酮類物質(zhì)低，但由花生四烯酸氧化形成的1-辛烯-3-醇經(jīng)常從干腌火腿中檢出，且具有較低的閾值，被認(rèn)為是盤縣火腿[19]、金華火腿[28]及如皋火腿[29]的特征風(fēng)味。在本研究中，1-辛烯-3-醇是正常火腿中最豐富的醇，也是正常與腐敗火腿之間的鑒別因子。

烴類物質(zhì)在種類和含量上的差異也有助于區(qū)分正常和腐敗盤縣火腿。正常和腐敗盤縣火腿中的烴類物質(zhì)分別占樣品風(fēng)味總面積的0.54%和13.51%。Martín等[27]在未變質(zhì)（3.98%）和變質(zhì)伊比利亞火腿（12%）中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。通常，烴類化合物因其較高的閾值而對火腿風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，但一些烯烴類物質(zhì)可能會(huì)影響整體風(fēng)味。1-十五烯是腐敗盤縣火腿中的特征化合物，占風(fēng)味總面積11.05%。據(jù)報(bào)道，它也是異味薏仁米中最主要的揮發(fā)性成分[30]。

含苯化合物是腐敗盤縣火腿中最主要的風(fēng)味成分，51.66%的峰面積由這類化合物代表。其中，含量較高的苯酚和苯乙醛是腐敗火腿的標(biāo)志性風(fēng)味。苯酚是一種具有特殊臭味的化合物，適量的苯酚似乎有助于發(fā)酵肉制品的風(fēng)味[31]，但高含量的苯酚會(huì)影響金華火腿的風(fēng)味[32]。同時(shí)，苯酚具有毒性，已被世界衛(wèi)生組織列入致癌物質(zhì)清單。苯乙醛是一種具有花香的氨基酸衍生物，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于國內(nèi)外干腌火腿中[33-34]。然而，高含量的苯乙醛已被認(rèn)為是伊比利亞火腿腐敗的特征之一[35]。

與之前研究結(jié)果一致[19]，在正常盤縣火腿中未檢出含硫化合物。兩種含硫化合物（二甲基二硫醚和二甲基四硫化物）僅存在于腐敗火腿中，占風(fēng)味總面積的6.52%。硫化物代表燒焦和臭雞蛋的不愉快氣味，通常來自于微生物對含硫氨基酸的降解[36]。如圖2B所示，二甲基二硫醚被鑒定為腐敗盤縣火腿的特征風(fēng)味化合物。盡管二甲基二硫醚已被描述為金華和如皋火腿的主體風(fēng)味成分[28-29]，但這類化合物在變質(zhì)伊比利亞火腿中的含量遠(yuǎn)高于未變質(zhì)火腿[25,35]。

3-甲基丁酸也是腐敗盤縣火腿的特征風(fēng)味。在伊比利亞火腿中，3-甲基丁酸的氣味被描述為像腳的、酸的和變質(zhì)火腿的味道，且僅在腐敗火腿中檢測到[35]。腐敗火腿中高含量的3-甲基丁酸可以通過以下兩方面解釋：1）3-甲基丁醛氧化形成3-甲基丁酸；2）腸桿菌科的高蛋白酶活性促進(jìn)游離氨基酸的釋放，氨基酸通過微生物發(fā)酵生成3-甲基丁酸。對于含氮化合物，四甲基吡嗪僅存在于正?；鹜戎?，而N,N-二甲基-4-吡啶僅在腐敗火腿中檢測到。雖然有研究提出應(yīng)該將一些吡嗪類化合物視為檢測伊比利亞火腿初期腐敗的指標(biāo)，但不包括四甲基吡嗪[27]。

2.4 環(huán)境因子對微生物群落的影響

物理化學(xué)性質(zhì)的改變顯著影響微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成。合適的溫度、水分和鹽含量不僅有助于火腿獨(dú)特風(fēng)味的形成，還可以抑制有害微生物的生長繁殖[37]。因此，應(yīng)用RDA揭示優(yōu)勢菌屬與環(huán)境因子間的關(guān)系。銳角表示菌屬與環(huán)境因子之間呈正相關(guān)，而鈍角表示呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果如圖3所示。水分含量、aw和pH值與未分類腸桿菌科微生物呈顯著正相關(guān)，而與沙雷氏菌屬（Serratia）的正相關(guān)較弱。同時(shí)，NaCl濃度顯示出對沙雷氏菌屬的強(qiáng)烈抑制，這種顯著負(fù)相關(guān)已在腐敗伊比利亞火腿中觀察到[6]。相反，NaCl濃度與其余優(yōu)勢菌屬呈正相關(guān)，特別是色鹽桿菌（Chromohalobacter）和鹽單胞菌（Halomonas）。這兩個(gè)屬的大多數(shù)成員具有嗜鹽性，經(jīng)常從高鹽發(fā)酵食品中分離出來[38-39]，具有蛋白酶和脂肪酶活性[40]。據(jù)報(bào)道，色鹽桿菌是韓國醬油品質(zhì)形成的關(guān)鍵[41]，而鹽單胞菌的成員具有降解生物胺的能力[42]。正?；鹜戎凶钬S富的葡萄球菌與NaCl濃度的正相關(guān)較弱，但與水分含量、aw和pH值呈強(qiáng)烈負(fù)相關(guān)。類似地，最近一項(xiàng)研究揭示了肉類發(fā)酵過程中pH值對葡萄球菌群落結(jié)構(gòu)的顯著影響[43]。

圖3 優(yōu)勢細(xì)菌屬與環(huán)境因子之間的RDAFig. 3 RDA of the relationship between dominant bacterial genera and environmental factors

2.5 優(yōu)勢菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味化合物之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

干腌火腿加工過程中伴隨著一系列的生化和酶促反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)水解、脂質(zhì)氧化、糖原分解和美拉德反應(yīng)等，這些反應(yīng)對火腿風(fēng)味的形成至關(guān)重要。眾所周知，肌肉內(nèi)源酶，特別是組織蛋白酶主導(dǎo)這些反應(yīng)，而微生物的酶促作用也有助于風(fēng)味化合物的產(chǎn)生[44]。據(jù)報(bào)道，微生物或未知來源的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)占伊比利亞火腿總揮發(fā)性化合物的5.7%[29]和6.9%[45]。另外，郇延軍等[46]認(rèn)為微生物是影響不同等級金華火腿風(fēng)味的關(guān)鍵因素。因此，基于Pearson相關(guān)系數(shù)構(gòu)建優(yōu)勢菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。如圖4所示，代表正?；鹜鹊? 種細(xì)菌屬和主導(dǎo)腐敗火腿的3 種細(xì)菌屬構(gòu)成兩個(gè)單獨(dú)的網(wǎng)絡(luò)，分別促進(jìn)32 種和21 種風(fēng)味化合物的產(chǎn)生。與圖2結(jié)果一致，正?；鹜纫匀╊惡痛碱愇镔|(zhì)為主，而腐敗火腿以酮類、烴類、含苯和含硫化合物為代表。然而，在圖4A中觀察到苯甲醛和3 種酮的存在。雖然腐敗火腿中更高含量的苯甲醛已被報(bào)道[27]，但這種具有苦杏仁和橡子氣味的化合物在干腌火腿中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，并且被認(rèn)為是伊比利亞火腿的氣味活性成分[47]。如圖4B所示，2 種未知的腸桿菌科微生物與腐敗火腿的5 種特征風(fēng)味（苯酚、苯乙醛、1-十五烯、3-甲基丁酸和二甲基二硫醚）密切相關(guān)，而沙雷氏菌屬只與苯酚、苯乙醛和3-甲基丁酸的產(chǎn)生有關(guān)。同時(shí)，沙雷氏菌屬僅占腐敗火腿總豐度的8.85%（圖1B）。因此，盡管許多研究認(rèn)為沙雷氏菌屬是造成干腌火腿腐敗的主要腸桿菌科微生物[6,21]，但它可能并不是導(dǎo)致盤縣火腿腐敗的關(guān)鍵因素。造成這種差異的原因之一可能是此前的研究均采用培養(yǎng)法，大部分微生物無法培養(yǎng)的局限性導(dǎo)致研究者得出值得商榷的結(jié)論。有必要應(yīng)用準(zhǔn)確性更高、測序深度更深的宏基因組進(jìn)行下一步研究。

圖4 優(yōu)勢細(xì)菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味化合物的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)Fig. 4 Correlation network between dominant bacterial genera and volatile flavor compounds

3 結(jié) 論

本研究揭示了正常與腐敗盤縣火腿在理化特性、微生物多樣性和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的差異，確定了與腐敗火腿高度相關(guān)的幾種特征，即高比例的腸桿菌科和高含量的苯酚、苯乙醛、1-十五烯、3-甲基丁酸及二甲基二硫醚，這對預(yù)防和減少盤縣火腿的腐敗具有重要意義。然而，目前基于16S rRNA的高通量測序未能準(zhǔn)確鑒定出主導(dǎo)盤縣火腿腐敗的微生物。因此，后續(xù)研究中，應(yīng)該使用基于第3代測序的宏基因組進(jìn)一步在屬水平和/或物種水平上表征這些微生物，并利用多組學(xué)技術(shù)（如蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)）驗(yàn)證它們與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的關(guān)系。