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    氣相色譜-質譜聯(lián)用代謝組學技術分析不同產地稻米代謝物

    2021-05-19 07:05:38王長遠馮玉超盛亞男富天昕張藝瑋姜穎俊張麗媛
    食品科學 2021年8期
    關鍵詞:稻米代謝物產地

    張 舒,王長遠,*,馮玉超,盛亞男,富天昕,張藝瑋,姜穎俊,于 淼,張麗媛

    (1.黑龍江八一農墾大學食品學院,黑龍江 大慶 163319;2.國家雜糧工程技術研究中心,黑龍江 大慶 163319)

    代謝組學主要是將某種物質內所有小分子代謝物(氨基酸、糖醇類化合物、脂類等)在不同生長環(huán)境、時期以及外界刺激下的代謝應答變化作為研究對象,并對其進行定性、定量的多種統(tǒng)計分析[1],在物質相關指標分析的基礎上,通過高通量檢測和數(shù)據(jù)處理的手段,進行系統(tǒng)性信息整合,從而對生物體代謝規(guī)律進行研究的一門科學[2]。代謝組學分析不僅可以觀察物質代謝產物含量的變化,還可以從分子水平掌握其動態(tài)信息,將代謝產物與時間、地域、環(huán)境等因素聯(lián)系起來探究代謝產物與各因素間的變化規(guī)律,從整體水平上評價物質的生物效應[3-4]。目前國內外主要通過檢測分析礦物質元素[5]、穩(wěn)定性同位素[6-7]、核磁共振[8]、近紅外光譜[9]、DNA指紋、氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[10]、液相色譜-質譜[11-12]等分析方法進行農產品品質、產地鑒別和溯源的研究[13];每種分析手段都有優(yōu)勢,但目前靠單一的分析手段還無法獲得代謝物的全部信息,因此需要采取多種方法和技術聯(lián)合使用。

    目前稻米是世界上最為主要的糧食之一,是人類和牲畜攝取碳水化合物的主要來源,具有適應性強、產量高、經濟效益高的特點[14]。稻米中含有種類豐富的初生代謝物和次生代謝物,存在基本營養(yǎng)物質外還包含白藜蘆醇、兒茶素、生物堿等生物活性物質。除了本身遺傳因素的影響,水質、局部氣候、土壤條件、晝夜溫差等環(huán)境因素對稻米品質的影響也十分顯著,這些因素塑造了具有典型地域特色的地理標志產品,使栽培具有明顯的區(qū)域性[15]。Kawasaki等[16]針對日本、中國、澳大利亞、美國和越南5 個國家大米樣品中的同位素11B/10B和87Sr/86Sr值采用電感耦合等離子體質譜進行分析,發(fā)現(xiàn)2 種同位素值差距較大。王希越等[17]通過GC-MS技術對不同產地稻米油脂中脂肪酸進行研究,發(fā)現(xiàn)不同品種的稻米脂肪輪廓存在較大差異。由于我國稻米種植區(qū)域廣、種類多、品質差距較大,為了防控以次充好的現(xiàn)象,探究一種高效、可靠的稻米產地鑒別及溯源方法尤為重要。本實驗以黑龍江省五常地理標志稻米保護區(qū)和查哈陽地理標志稻米保護區(qū)的水稻樣本為研究對象,通過GC-MS技術的代謝組學平臺,對2 個地理標志性產地的稻米進行代謝物的差異分析,探究產地對稻米代謝及代謝產物的影響情況,以期為稻米產地鑒別及溯源提供數(shù)據(jù)支持和理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    稻米采自黑龍江省查哈陽和五常地理標志性產地,依據(jù)代表性采樣原則,采用五點采樣法進行隨機采集,每個采樣點采集1~2 kg稻穗。每個產區(qū)選取30 個樣本,五常地區(qū)選擇9 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)布點進行樣本的采集,稻米品種主要為稻花香水稻,分別為綏粳4、五優(yōu)4號、龍稻16、創(chuàng)新918;查哈陽地區(qū)選擇6 個管理區(qū)布點進行樣本的采集,稻米品種分別為綏粳4、五優(yōu)4號、龍粳26、龍粳29、龍粳31、龍粳39、松粳9。稻米采集自2017年。

    甲醇、吡啶(色譜級,純度≥99.9%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;2-氯苯丙氨酸、甲氧基胺鹽酸鹽、99%雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+1%三甲基氯硅烷、N,O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺 麥克林試劑有限公司。

    1.2 儀器與設備

    7890A/5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司;色譜柱HP-5ms(30 m×0.25 mm,0.25 μm) 美國Agilent J&W Scientific公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品采集及處理

    稻米樣品的前處理采用馮玉超等[18]的方法。

    1.3.2 GC-MS檢測

    進樣口溫度280 ℃;電子電離源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;高純氦氣(純度>99.999%)作為載氣,不分流進樣,進樣量1.0 μL。升溫程序:初始溫度80 ℃,維持2 min,10 ℃/min升至320 ℃,并維持6 min。采用全掃描模式進行質譜檢測,質量掃描范圍m/z50~550。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    在R軟件平臺下采用XCMS軟件對GC-MS得到的原始數(shù)據(jù)進行特征峰的提取和處理,并利用SIMCA軟件進行多元統(tǒng)計分析。通過主成分分析(principal component analysis,PCA)對數(shù)據(jù)進行降維處理,并對整體的分布趨勢進行預覽,然后采用正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least square-discriminant analysis,OPLS-DA)對其進行建模,之后根據(jù)Student’st檢驗的P值小于0.05,同時OPLS-DA模型主成分的變異權重參數(shù)(variable importance in projection,VIP)值大于1,進行差異性代謝物的篩選。差異性代謝物根據(jù)保留時間及質荷比在Fiehn代謝組數(shù)據(jù)庫進行注釋,對篩選出的差異代謝物進行KEGG注釋,檢索出差異代謝物映射的所有通路,然后通過富集分析和拓撲分析對差異代謝物所在的通路進一步篩選,找到與代謝物差異相關性最高的關鍵通路。

    2 結果與分析

    2.1 代謝物定性

    代謝物通過Fiehn數(shù)據(jù)庫進行定性,五常地區(qū)共檢測出127 個代謝物,查哈陽地區(qū)共檢測出142 個代謝物。兩產地相比較,同時存在的代謝物有102 個,五常稻米特有代謝物25 個,查哈陽稻米特有代謝物40 個。代謝物定性結果如表1所示。

    表1 代謝物定性結果Table 1 Qualitative results of metabolites in rice

    續(xù)表1

    續(xù)表1

    續(xù)表1

    由表1可知,兩產地共定性出包括氨基酸及其衍生物、脂肪酸及其衍生物、有機酸、糖類及其衍生物、固醇類及其他類物質代謝物167 種;其中其他類物質多為醇、烷、腈以及少部分生物活性物質。兩產地特有的代謝物相比較,查哈陽特有代謝物中糖類物質和其他代謝物所占比例顯著高于五常,兩產地特有的代謝物的氨基酸和脂肪酸類所占比例均較少,查哈陽包含種類略低于五常;此外五常代謝物中含有亮氨酸等必需氨基酸,而查哈陽未檢測出必需氨基酸物質;查哈陽的特有代謝物中包含一種固醇類代謝物二氫膽固醇,而五常地區(qū)的特有代謝物無固醇類代謝物。由此說明,相同品種的稻米,由于產地不同,其代謝物組分的種類和含量也具有一定的差異,代謝物的組成和含量是影響稻米風味品質的重要指標之一[19]。

    2.2 PCA結果

    圖1 查哈陽與五常地區(qū)樣本的PCA模型得分散點圖Fig. 1 Score scatter plot of PCA model for rice samples from Chahayang and Wuchang

    2.3 OPLS-DA結果

    PCA能夠直觀顯示樣本間的分組、變化趨勢和相似性關系,但差異變量會分布在各PC上,無法在后面的分析中將其剔除做更準確的分析。而OPLS-DA是多元統(tǒng)計分析方法中一種常用的有監(jiān)督的分析方法,釆用偏最小二乘法對高維數(shù)據(jù)降維,然后再用線性判別,可除去代謝物中與分類變量不相關的正交變量,這樣不但實現(xiàn)了數(shù)據(jù)的可視化,而且取得了較好的后期判別效果[20]。

    圖2 查哈陽對五常地區(qū)樣本的OPLS-DA模型得分散點圖Fig. 2 Score scatter plot of OPLS-DA model for rice samples from Chahayang and Wuchang

    圖3 查哈陽地區(qū)對五常地區(qū)樣本的OPLS-DA模型的置換檢驗結果Fig. 3 Permutation test of OPLS-DA model for rice samples from Chahayang and Wuchang

    如圖3所示,R2和Q2的回歸線與橫坐標交叉或者小于0,說明評估模型可靠有效[22]。R2代表Y變量的可解釋性,Q2代表模型的可預測性,原模型比較接近1,說明建立的模型比較符合樣本數(shù)據(jù)的真實情況;原模型Q2大于0.5證明原模型可以較好地解釋2 組樣本之間的差異[23]。Q2于Y軸的截距是負值,且置換檢驗得到的R2=-0.13和Q2=-0.99均小于OPLS-DA置換檢驗中和Q2的原始值,由此可得此模型無過擬合現(xiàn)象。

    2.4 差異代謝物的篩選

    篩選兩產地間稻米差異代謝物的標準為OPLS-DA模型主成分的VIP值大于1且t檢驗的P值小于0.05,結合Fiehn數(shù)據(jù)庫通過保留時間等條件與庫中物質進行匹配,從而進行兩產地稻米差異代謝物的定性,如表2所示。

    差異代謝物是兩產地同時存在的,但是含量上存在顯著差異。查哈陽與五常稻米代謝物對比,共篩選出32 個差異代謝物,多數(shù)為糖類以及糖類的衍生物,還有少量有機酸、氨基酸、脂肪酸、固醇類及其他類物質。由表2可知,這32 個差異物質中,查哈陽稻米樣本中有13 個代謝物的含量低于五常,這些物質多數(shù)屬于其他類物質,主要為生物活性物質酚類、醇類、腈類等;也包括少數(shù)的脂肪酸。查哈陽稻米樣本中有19 個代謝物的含量高于五常,這些物質多數(shù)為糖類及糖類的衍生物,倍性變化在0.34~2.44 倍之間。研究表明適宜的溫度和充足光照有益于稻米強勢籽粒的生長,而強勢籽粒會提早進入淀粉糖快速累積的時期,使干物質積累多,可塑溶解的雙鏈糖含量高,從而對稻米中糖類物質的含量和成分有較大的影響[24-25]。查哈陽地區(qū)屬于寒溫帶大陸季風氣候,日照時數(shù)為2 773 h,而五常地區(qū)屬于中溫帶大陸性季風氣候,日照時數(shù)為2 629 h,不同的氣候條件可能是導致查哈陽稻米中糖類含量高于五常的主要原因。此外查哈陽地理標志稻米保護區(qū)的土壤類型以草甸黑鈣土為主,具有疏松、肥沃、種植強度低的特點,而五常地理標志稻米保護區(qū)以層厚,基礎肥力高的黑土為主,不同土壤的土壤水勢對稻米代謝物的影響也會有較大差異[26]。

    表2 差異代謝物定性結果Table 2 Qualitative results of differential metabolites

    2.5 差異代謝物的聚類分析

    如圖4所示,五常樣本前13 個代謝物的表達量明顯高于查哈陽樣本代謝物的表達量,多數(shù)為酚類、醇類、萜類等物質,13 個代謝物中檢測出一個數(shù)據(jù)庫中檢索不到的未知物,該未知物在代謝通路中表達量和其余12 個已知物具有相似的高表達,故推斷該未知物的結構也屬于酚類、醇類、萜類等物質。剩余的19 個差異代謝物的表達量查哈陽明顯高于五常,這19 個差異代謝物多數(shù)為糖以及糖的衍生物,如左旋葡聚糖、半乳糖醇5、異麥芽酮糖醇、1,5-脫水葡萄糖醇等,可見查哈陽稻米可為人體提供更多的碳水化合物;此外查哈陽地區(qū)稻米的異亮氨酸、瓜氨酸等必需氨基酸的表達量也較高。通過層次聚類分析可以看出,產地對稻米中各類代謝物的含量具有顯著影響,而差異代謝物是眾多代謝物中因產地不同而導致含量變化顯著的物質,則差異代謝物對于稻米產地鑒別具有一定的參考意義。

    2.6 差異代謝物的代謝通路分析

    植物在生長過程中需要經過多種物質和反應共同調控,是十分復雜的代謝過程,并不能從某一種物質的含量高低進行整體判斷,因此需進一步對其代謝通路進行分析。通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)中的Pathway數(shù)據(jù)庫,共檢索到差異代謝物參與的18 條代謝通路,分別為類固醇生物合成、次生代謝物的生物合成、檸檬酸循環(huán)、脂肪酸生物合成、氧化磷酸化、精氨酸生物合成、嘧啶代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、酪氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、丙酮酸代謝、丁酸鹽代謝、煙酸鹽和煙酰胺代謝、泛酸鹽和CoA生物合成、倍半萜和三萜生物合成、碳代謝。

    將上述篩選鑒定的差異代謝物匹配信息后,利用對應物種的通路數(shù)據(jù)庫對其進行富集分析和拓撲結構分析,根據(jù)代謝通路的濃縮,識別出可能的受生物擾動的代謝通路[27]。首先,通過差異代謝物對KEGG、PubChem等權威代謝物數(shù)據(jù)庫進行映射,映射出5 個物質,脲基丙酸、角鯊烯、膽固醇、月桂酸、反丁烯二酸,且均為精確匹配。對差異代謝物和通路進行相關性分析,得到多條相關通路。根據(jù)-lnP值和Impact值綜合分析,篩選出最為顯著的9 條代謝通路,如表3所示。

    表3 代謝通路分析Table 3 Metabolic pathway analysis

    圖4 查哈陽與五常地區(qū)樣本的層次聚類分析熱圖Fig. 4 Heatmap of hierarchical clustering analysis for rice samples from Chahayang and Wuchang

    對差異代謝物參與的代謝通路分析,共發(fā)現(xiàn)9 條關鍵通路,關鍵通路與代謝物差異相關性較高,見表3。可以發(fā)現(xiàn)這9 條通路多數(shù)為氨基酸代謝,則說明產地對稻米代謝中的氨基酸代謝具有一定影響。而這9 條通路映射的代謝物有5 個,月桂酸主要參與氨基酸代謝、反丁烯二酸主要參與糖代謝,角鯊烯和膽固醇主要參與固醇代謝,此外角鯊烯也可參與合成皂苷類物質代謝途徑和合成植物甾醇類物質途徑等[28],同一代謝物同時參與多條代謝通路,說明映射出的差異代謝物對通路影響較大。

    圖5 查哈陽對五常地區(qū)樣本的通路分析圖Fig. 5 Pathway analysis for Chahayang versus Wuchang rice samples

    如圖5所示,氣泡代表代謝通路,氣泡顏色越深P值越小,富集程度越顯著;氣泡大小表示影響因子大小,氣泡越大影響因子越大。類固醇生物合成處的氣泡顏色最深、氣泡相對較大,說明產地不同,對稻米中固醇類物質的影響最顯著,角鯊烯和膽固醇是該通路中重要的代謝物。已有研究表明脂類化合物的含量是影響米飯可口性和米飯光澤的主要因素[13,29],而固醇類物質屬于脂類物質,產地差異對稻米食味品質具有較大影響。β-丙氨酸代謝、泛酸鹽和輔酶A生物合成2 個通路氣泡都較大,說明2 個代謝途徑對稻米代謝的影響也較大。其次是檸檬酸循環(huán),該代謝途徑是糖、脂肪、蛋白質3 種主要有機物質徹底氧化的共同代謝途徑。而月桂酸主要參與的脂肪酸代謝的影響因子和富集程度相對較小,通常以其含量評價稻米的蛋白質質量[30]。由代謝通路結果可知,查哈陽與五常2 個產區(qū)的稻米,在代謝中最大的差異是類固醇生物合成代謝過程,而對脂肪酸代謝影響也較大,則說明脂類物質受產地環(huán)境的影響較大[31-32],同時,氨基酸代謝通路在產地差異中相關性也很高,說明產地對稻米中脂類物質及氨基酸類物質的影響較大,但其受產地影響的機理目前尚不明確。

    3 結 論

    GC-MS的代謝組學技術研究產地對稻米代謝產物的影響具有可行性。結果表明,產地對稻米中代謝物的數(shù)量、種類及含量均具有影響,其中種類和含量的差異較顯著,查哈陽稻米中的糖類、氨基酸、脂肪酸含量均高于五常稻米,相比較而言,查哈陽稻米的食味品質可能更好一些。兩產地對比共篩選出含量顯著變化的差異代謝物32 個,其中查哈陽稻米樣本中有13 個代謝物的含量低于五常,主要為酚類、醇類、腈類、脂肪酸等;查哈陽稻米樣本中有19 個代謝物含量高于五常地區(qū),這些物質多數(shù)為糖類及糖類的衍生物。產地不同,不同種類代謝物的含量存在顯著差異,則差異代謝物可作為稻米產地區(qū)分的參考物質。代謝通路分析發(fā)現(xiàn),產地對稻米中脂類物質及氨基酸類物質的代謝具有顯著影響,角鯊烯、膽固醇、脲基丙酸、反丁烯二酸和月桂酸是關鍵代謝物質。

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