基于高通量測序?qū)γ┡_鎮(zhèn)醬香白酒主釀區(qū)霉菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性的解析

朱治宇，黃永光

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

以貴州茅臺酒為代表的醬香型白酒工藝復(fù)雜、香氣成分豐富，具有醬香突出、酒體醇厚、空杯留香持久等特點[1]。醬香白酒釀造是自然開放式、多菌固態(tài)發(fā)酵過程，其中開放式制曲和堆積發(fā)酵是網(wǎng)羅環(huán)境微生物必不可少的工藝[2]，說明釀造環(huán)境中必然大量存在與發(fā)酵相關(guān)的微生物。王雪山[3]對清香白酒大曲、環(huán)境（地面、工具等）以及新廠和老廠之間進(jìn)行了微生物多樣性探究，結(jié)果表明不同環(huán)境中、不同廠區(qū)之間微生物種群結(jié)構(gòu)均具有明顯差異；任愛容等[4]采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)從醬香白酒大曲和環(huán)境中得到細(xì)菌28 個屬，其中大曲18 個屬、環(huán)境24 個屬，結(jié)果表明大曲與環(huán)境微生態(tài)結(jié)構(gòu)具有差異性，環(huán)境微生物多樣性較高，為發(fā)酵提供了必需的微生物資源；Wang Qiang等[5]應(yīng)用DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)茅臺酒發(fā)酵酒醅中多種微生物來源于大曲、窖泥、原料和環(huán)境（空氣、灰塵和地面等）；羅方雯等[6]應(yīng)用高通量技術(shù)從醬香白酒釀造區(qū)域環(huán)境和大曲中檢測到多種酵母，且大曲中90%以上的酵母來源于環(huán)境。由此可見，研究釀造環(huán)境微生物多樣性對深入解析醬香白酒發(fā)酵機(jī)理具有重要意義。

大曲作為糖化發(fā)酵劑，富含多種酶系和微生物資源，對提升發(fā)酵動力和酒體風(fēng)格具有重要意義[7-8]，制曲過程包含細(xì)菌、酵母、霉菌等菌群結(jié)構(gòu)的演替，其中霉菌在釀造過程發(fā)揮著重要作用，能產(chǎn)生糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等水解酶系，對降解發(fā)酵原料和產(chǎn)生白酒中呈香呈味物質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)[9-10]。夏玙等[11]采用高通量測序分析大曲中真菌群落結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根毛霉屬（Rhizomucor）、曲霉菌屬（Aspergillus）等霉菌是大曲中的優(yōu)勢真菌類群；班世棟等[12]采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)從醬香型白酒大曲中分離得到Aspergillus、紅曲霉屬（Monascus）、毛霉屬（Mucor）、青霉屬（Penicillium）、Rhizomucor等19 株霉菌；李靜心等[13]采用高通量測序技術(shù)從大曲中分離出Aspergillus、Thermomyces和Rhizomucor等優(yōu)勢霉菌。研究結(jié)果表明，醬香大曲中霉菌資源豐富，其復(fù)雜的菌群多樣性結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律值得深入探討。

本課題基于MiSeq平臺，采用高通量測序技術(shù)系統(tǒng)性研究茅臺鎮(zhèn)主釀區(qū)生產(chǎn)大曲和釀造環(huán)境中霉菌菌群結(jié)構(gòu)多樣性（跟蹤整個醬香白酒釀造周期）。實驗樣品來源于茅臺鎮(zhèn)釀酒企業(yè)相對集中的7 個主釀區(qū)，同時采用可培養(yǎng)技術(shù)完善數(shù)據(jù)并加以驗證，采用統(tǒng)計學(xué)方法分析各主釀區(qū)之間、生產(chǎn)大曲和釀造環(huán)境之間霉菌菌群結(jié)構(gòu)差異性，通過對比各主釀區(qū)霉菌多樣性指數(shù)、富集率、衰減率和遷移率變化，以期為醬香白酒生產(chǎn)大曲和釀造環(huán)境微生態(tài)結(jié)構(gòu)研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，并從微生物角度為酒廠的選址提供理論依據(jù)。課題組同時對各主釀區(qū)堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵過程中微生物結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行實驗探究，以期完善醬香白酒微生物數(shù)據(jù)庫的科學(xué)性和全面性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自貴州省茅臺鎮(zhèn)TMS、GT、DDH等17 家醬香型白酒公司的白酒生產(chǎn)車間2018—2019年1～7輪次主釀區(qū)環(huán)境和大曲。

DNA Marker（TaKaRa）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、引物（合成） 生工生物工程（上海）股份有限公司；E.Z.N.A. Soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司；異丙醇（分析純）、TEA緩沖液北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司；Goldview染料 上海賽百盛有限公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽（廈門）儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；DYY-8C型電泳儀北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國Promega公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

樣品取自貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)觀音寺區(qū)、上坪村、椿樹村、巖灘村、向陽村、盧榮壩村及合馬鎮(zhèn)街道社區(qū)共7 個醬香白酒主釀區(qū)的17 個代表性釀酒企業(yè)，2018年1—9月1～7輪次酒醅堆積發(fā)酵期間的釀造環(huán)境樣品和生產(chǎn)使用大曲樣品。環(huán)境樣品采集：企業(yè)生產(chǎn)車間的晾堂、墻角地面土塵、灰塵，窗戶玻璃、窗臺、墻體、行車梯子、配電箱、消防箱、儲酒罐表面的灰塵、粉塵，車間外地面、溝渠表面土質(zhì)粉塵，對各采樣點均進(jìn)行固定、定期、定量采集樣品，再將采樣點采集的樣品進(jìn)行等量均值混勻，每個企業(yè)收集混合樣500 g（1 個輪次、1 個企業(yè)），準(zhǔn)確標(biāo)記每個取樣點以防被破壞，且每次都在相同取樣點取樣。大曲樣品：在采集環(huán)境樣品時于釀酒企業(yè)大曲曲房采集使用前的貯存曲樣，每企業(yè)取樣量500 g，采樣大曲均為釀酒企業(yè)生產(chǎn)。

樣品采集后均密封裝袋，作為該輪次樣品（17 個采集釀造企業(yè)1～7輪次共計119 個大曲樣品和119 個環(huán)境樣品），并立即運(yùn)回實驗室即時開展分析研究（24 h內(nèi)），實驗室留存樣品均放置于-20 ℃冰柜貯存。按照區(qū)域劃分將每個酒廠的樣品等量混合為代表一個區(qū)域的最終混合樣品（本實驗采用共分為7 個區(qū)域，每個區(qū)域1 個最終混合樣品，7 個輪次共計49 個大曲最終混合樣品和49 個環(huán)境最終混合樣品）。

1.3.2 樣品處理

1）分別取1.3.1節(jié)最終混合樣品各16 g于100 mL離心管中，用30 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮，加入3～5 顆玻璃珠，旋渦振蕩7 min，400 r/min離心5 min，取上清液。2）沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩4 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。3）將沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩2 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。全部上清液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。4）預(yù)處理結(jié)束后，根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的微生物總DNA。

1.3.3 16S rDNA基因擴(kuò)增及Illumina MiSeq測序

使用16S rDNA通用真菌引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對真菌ITS1FITS2R區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。每個樣本做3 個重復(fù)。將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；1.1%瓊脂糖電泳檢測。

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測并定量，再按照每個樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板富集，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，制備MiSeq PE文庫。再在Illumina MiSeq（PE300）平臺上機(jī)測序[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用WPS 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Origin 8.6繪制堆積柱狀圖和柱形圖，RStudio繪制Upset plot、pheatmap、Venn圖及和弦圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌多樣性分析

采用堆積柱形圖直觀呈現(xiàn)樣本中各霉菌的相對豐度（平均相對豐度＞0.1%）。對茅臺鎮(zhèn)醬香白酒7 個主釀區(qū)大曲和環(huán)境樣品霉菌的高通量測序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 主釀區(qū)生產(chǎn)用大曲（a）和環(huán)境（b）霉菌群落結(jié)構(gòu)多樣性在屬水平上的分布（相對豐度≥0.1%）Fig. 1 Genus-level distribution of mold community structure in Daqu (a)and environmental samples (b) from the main brewing areas (relative abundance ≥ 0.1%)

從7 個主釀區(qū)生產(chǎn)用大曲中共檢出霉菌68 個屬，有11 個屬相對豐度至少在一個樣品中超過0.1%（圖1a），分別是：Aspergillus、Auxarthron、Byssochlamys、Microascus、Monascus、Penicillium、Rhizomucor、Rhizopus、Thermoascus、Thermomyces、Trichothecium。其中優(yōu)勢霉菌屬（相對豐度≥1%）為Aspergillus（4.14%～11.8%）、Byssochlamys（13.0%～44.8%）、Monascus（1.41%～18.8%）、Thermoascus（25.9%～67.4%）、Thermomyces（7.70%～23.3%）、Rhizomucor（0.02%～5.70%）。由圖1a可知，Thermoascus在區(qū)域1和區(qū)域6相對豐度均高于60%，是7 個區(qū)域大曲樣品中平均相對豐度（48.8%）最高的優(yōu)勢霉菌，Thermoascus具有良好的酶分泌特性，產(chǎn)過氧化氫酶（除去過氧化氫等細(xì)胞毒性物質(zhì)）、內(nèi)切葡聚糖酶（纖維素酶系主要組成之一）、葡萄糖苷酶（分解葡萄糖苷鍵，是微生物代謝重要酶類之一）、角質(zhì)酶（食品工業(yè)具有催化酯化作用）和幾丁質(zhì)酶（水解幾丁質(zhì)抑制真菌病原菌）等多種酶系[15]；Byssochlamys平均相對豐度（22.8%）次之，具有耐熱、耐低氧、耐酸和產(chǎn)果膠酶等特性[16]；Monascus、Aspergillus、Rhizomucor等優(yōu)勢霉菌同樣產(chǎn)酶豐富，為持續(xù)發(fā)酵和促進(jìn)風(fēng)味及其前體物質(zhì)的形成提供動力[10,17-18]。本課題同時采用傳統(tǒng)平板分離技術(shù)鑒定了7 個主釀區(qū)醬香大曲中的可培養(yǎng)霉菌，數(shù)據(jù)顯示Aspergillus和Thermoascus是樣品中的優(yōu)勢霉菌（平均相對豐度≥20%），與高通量分析結(jié)果對應(yīng)性較好，但Monascus和Rhizomucor在可培養(yǎng)條件下相對豐度較小且Byssochlamys未篩出，可能是因為可培養(yǎng)與高通量技術(shù)存在檢測手段和培養(yǎng)條件的不同，使檢出結(jié)果存在一定差異，相比傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)，高通量測序分析能更全面與準(zhǔn)確地分析樣品的微生態(tài)結(jié)構(gòu)[19]。郭敏等[7]應(yīng)用高通量測序分析，從傳統(tǒng)大曲、機(jī)械化大曲制曲過程樣品中檢出真菌共58 個屬，大曲入曲房時優(yōu)勢霉菌包括Thermoascus、Thermomyces、Aspergillus等；第1次翻曲為Thermoascus、Thermomyces等；第2次翻曲為Byssochlamys、Aspergillus等；出房時為Byssochlamys、Thermomyces等，該實驗對整個制曲過程微生態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了解析，具有較高的參考價值。對比分析發(fā)現(xiàn)，本實驗大曲樣品中優(yōu)勢霉菌種類一致但檢出量達(dá)到了68 個屬，原因為采集了茅臺鎮(zhèn)大量的企業(yè)樣品，樣品豐富導(dǎo)致檢測霉菌相對較多（更多對照結(jié)果見表1）。

從7 個主釀區(qū)環(huán)境中共檢出霉菌89 個屬，有26 個屬相對豐度至少在一個樣品中超過0.1%（圖1b），分別是：Acremonium、Alternaria、Aspergillus、Byssochlamys、Cladosporium、Cyphellophora、Fusarium、Fusicolla、Gibberella、Kabatiella、Lecythophora、Microascus、Monascus、Mortierella、Mucor、Penicillium、Phoma、Pyrenochaeta、Rhizomucor、Rhizopus、Simplicillium、Talaromyces、Thermoascus、Thermomyces、Toxicocladosporium、Trichothecium。其中優(yōu)勢霉菌屬（平均相對豐度≥1%）為Alternaria（0%～2.80%）、Aspergillus（10.4%～75.9%）、Byssochlamys（2.75%～13.8%）、Cladosporium（0.25%～31.0%）、Fusicolla（0%～2.08%）、Lecythophora（0%～10.7%）、Monascus（0.49%～10.2%）、Penicillium（0.56%～1.93%）、Phoma（0.01%～6.65%）、Pyrenochaeta（0%～22.9%）、Thermoascus（6.19%～49.0%）、Thermomyces（1.81%～12.4%）、Toxicocladosporium（0%～1.65%）。由此可知，在茅臺鎮(zhèn)醬香白酒主釀區(qū)環(huán)境中存在的霉菌多樣性極其豐富，且部分霉菌（Aspergillus、Byssochlamys、Monascus、Thermoascus、Thermomyces等）在與大曲制曲、貯存、酒醅堆積發(fā)酵過程遷移到大曲、酒醅中，并得到富集，成為優(yōu)勢菌種主導(dǎo)發(fā)酵（表1），本實驗與其他研究者檢出的優(yōu)勢霉菌契合度較高，驗證了優(yōu)勢霉菌的可靠性。通過對比7 個醬香白酒主釀區(qū)環(huán)境中的可培養(yǎng)霉菌數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Mucor、Aspergillus、Monascus、Rhizomucor等優(yōu)勢霉菌在可培養(yǎng)中同樣具有較高的豐度。研究發(fā)現(xiàn)雖然環(huán)境霉菌種類豐富，但并非都與發(fā)酵相關(guān)，如Phoma、Alternaria、Cladosporium等環(huán)境中的優(yōu)勢霉菌同時也是常見的病原菌，常寄生于植物引起多種病害[20-22]，可能會由原料或環(huán)境遷移到釀造過程，這是需要防控的微生物。

表1 基于高通量測序?qū)χ饕獌?yōu)勢霉菌的比較分析結(jié)果Table 1 Comparative analysis of dominant molds using high-throughput sequencing

綜上結(jié)果表明，大曲中優(yōu)勢霉菌（相對豐度≥1%）種類與前人研究結(jié)果具有相似性，通過功能性分析發(fā)現(xiàn)這些優(yōu)勢霉菌有利于發(fā)酵；環(huán)境霉菌多樣性豐富，提供益生菌的同時也存在大量豐度較高的病原菌，在生產(chǎn)上需要有效防控，盡量避免其遷移到發(fā)酵體系中。

2.2 各主釀區(qū)間霉菌差異性分析

運(yùn)用軟件RStudio繪制主釀區(qū)大曲霉菌（68 種）和環(huán)境霉菌（89 種）Upset plot分析各主釀區(qū)之間的霉菌差異性，如圖2所示。結(jié)果表明7 個主釀區(qū)同時共有的霉菌占比為：大曲（18 種，26.47%）、環(huán)境（26 種，29.21%）；而單獨出現(xiàn)在1 個區(qū)域的霉菌占比為：大曲（21 種，30.88%）、環(huán)境（7 種，7.87%）。數(shù)據(jù)分析表明：1）在大曲樣品中各主釀區(qū)霉菌種群結(jié)構(gòu)差異性較高（高達(dá)30.88%），說明各主釀區(qū)可能因為原料來源、水源、制曲工藝和發(fā)酵環(huán)境等因素的影響，使其中微生物多樣性產(chǎn)生較大差異。眾所周知“曲為酒骨”，大曲中富含多種微生物及其代謝產(chǎn)物，推動了酒醅發(fā)酵和呈香物質(zhì)及其前體物質(zhì)的產(chǎn)生和富集[8]，正是由于各主釀區(qū)大曲微生物種群差異性較高，才有可能導(dǎo)致各區(qū)域酒廠所釀醬香白酒質(zhì)量的差異。2）在環(huán)境樣品中各主釀區(qū)霉菌種群結(jié)構(gòu)差異性較低（7.87%），而7 個主釀區(qū)同時共有的霉菌相似度較高（高達(dá)29.21%），說明茅臺鎮(zhèn)整個環(huán)境微生態(tài)結(jié)構(gòu)具有相對穩(wěn)定性，得天獨厚的地理、氣候條件造就了穩(wěn)定的微生態(tài)大環(huán)境，正如“南橘北枳”一樣，這也證實了“離開茅臺鎮(zhèn)，就釀不出茅臺酒”的說法。

圖2 各主釀區(qū)大曲（a）和環(huán)境（b）樣品霉菌Upset plot分析Fig. 2 Upset plot analysis of mold communities in Daqu (a) and environmental samples (b) from the main brewing areas

為進(jìn)一步統(tǒng)計分析不同區(qū)域大曲和環(huán)境樣本中霉菌群落多樣性，采用α多樣性綜合分析主釀區(qū)之間的霉菌多樣性差異，繪制Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)分析圖，如圖3所示。

圖3 主釀區(qū)大曲樣品（a）和環(huán)境樣品（b）霉菌多樣性指數(shù)圖Fig. 3 Mold diversity indexes of Daqu (a) and environmental samples (b)from the main brewing areas

圖3 結(jié)果表明，茅臺鎮(zhèn)7 個主釀區(qū)霉菌多樣性具有一定差異，其中大曲樣品霉菌多樣性區(qū)域3最高，區(qū)域1最低；環(huán)境樣品霉菌多樣性區(qū)域6最高，區(qū)域1最低，主釀區(qū)之間的差異表明各區(qū)域酒廠具有不同霉菌種群結(jié)構(gòu)。綜合對比發(fā)現(xiàn)除區(qū)域1、3外，其余區(qū)域環(huán)境樣品霉菌多樣性均高于大曲樣品，說明環(huán)境樣品中霉菌多樣性普遍高于大曲樣品，而釀造環(huán)境為醬香白酒堆積發(fā)酵和開放式制曲工藝提供了微生物基礎(chǔ)。綜合圖1～3可知，區(qū)域2在7 個主釀區(qū)中微生態(tài)優(yōu)勢明顯，原因如下：1）區(qū)域2環(huán)境和大曲樣品中霉菌種類最多且多樣性指數(shù)較高，具有霉菌種群資源優(yōu)勢；2）區(qū)域2大曲樣品中霉菌種群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有利于發(fā)酵的霉菌比重較大；3）釀造過程中Aspergillus分泌酸性糖化酶、蛋白酶等重要酶系，為發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行和風(fēng)味物質(zhì)形成發(fā)揮著重要作用[10]，區(qū)域2環(huán)境樣品中Aspergillus相對豐度最高（高達(dá)75.9%），遷移至大曲后同樣具有較高的相對豐度（11.2%），表明區(qū)域2中Aspergillus含量高且對發(fā)酵環(huán)境脅迫耐受性較強(qiáng)，遷移至大曲后能夠成為主導(dǎo)發(fā)酵的優(yōu)勢菌種。綜上可知，區(qū)域2整體微生態(tài)環(huán)境相比其他區(qū)域優(yōu)勢明顯，對提供發(fā)酵動力和提升酒體風(fēng)格具有較大助力，該結(jié)論從微生物角度為酒廠的選址提供了理論依據(jù)。

2.3 主釀區(qū)生產(chǎn)大曲和釀造環(huán)境中霉菌種群結(jié)構(gòu)差異性分析

圖4 主釀區(qū)環(huán)境和大曲樣品霉菌屬水平Venn圖Fig. 4 Venn plot analysis of unique and shared molds between Daqu and environmental samples from the main brewing areas at the genus level

圖5 主釀區(qū)大曲樣品優(yōu)勢霉菌（屬）富集率（a）和環(huán)境樣品優(yōu)勢霉菌（屬）衰減率（b）pheatmap分析Fig. 5 Pheatmap analysis of enrichment rate of dominant mold genera in Daqu samples from main brewing area (a) and decay rate of dominant mold genera in environmental samples (b)

繪制Venn圖直觀分析醬香白酒主釀區(qū)環(huán)境和大曲樣品中霉菌屬水平差異性。由圖4可知，主釀區(qū)環(huán)境和大曲樣品共檢出95 種霉菌（屬）包括大曲68 種和環(huán)境89 種，其中62 種霉菌同時在2 個類別的樣品中檢出，占大曲樣品的91.18%和環(huán)境樣品的69.66%。值得注意的是，大曲中8.82%的霉菌未在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，這部分霉菌可能來源于原料、空氣或其他途徑，說明環(huán)境絕非大曲獲取微生物資源唯一途徑，但大曲在曲房開放式發(fā)酵、貯存過程中與環(huán)境霉菌資源交互作用最為明顯。

運(yùn)用軟件RStudio繪制pheatmap分析大曲樣品6 種優(yōu)勢霉菌（屬）富集率和環(huán)境樣品13 種優(yōu)勢霉菌（屬）衰減率（圖5）。醬香大曲的陳曲過程是對環(huán)境微生物的網(wǎng)羅和篩選[27]，并富集優(yōu)勢霉菌進(jìn)入酒醅后迅速主導(dǎo)發(fā)酵。通過分析大曲樣品6 種優(yōu)勢霉菌（屬）的富集變化可知（圖5a），Byssochlamys、Monascus、Thermoascus、Thermomyces、Rhizomucor等菌在制曲過程中發(fā)生了富集；通過分析環(huán)境樣品13 種優(yōu)勢霉菌（屬）的衰減變化可知（圖5b），Alternaria、Aspergillus、Cladosporium、Fusicolla、Lecythophora、Penicillium、Phoma、Pyrenochaeta、Toxicocladosporium等菌在與大曲進(jìn)行交互作用過程中發(fā)生了衰減。分析以上數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：1）各主釀區(qū)之間霉菌種群結(jié)構(gòu)共性特征明顯，具有相似的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)。2）如圖5b所示，環(huán)境中的優(yōu)勢霉菌遷移至大曲后因富集環(huán)境的變化而發(fā)生變化，甚至消亡（Pyrenochaeta）。由于醬香大曲制曲溫度較高（高達(dá)58～65 ℃）[28]，對釀酒微生物具有良好的篩選、富集特性，從而抑制了環(huán)境中多種酸敗微生物的生長，促進(jìn)了嗜熱細(xì)菌、霉菌的繁殖[29]。另外，高溫大曲在貯存環(huán)境富集的優(yōu)勢霉菌與發(fā)酵酒醅中的優(yōu)勢霉菌契合度非常高（表1），說明當(dāng)大曲在貯存期從環(huán)境中富集的優(yōu)勢霉菌進(jìn)入發(fā)酵酒醅后能夠迅速調(diào)控發(fā)酵，這就是醬香高溫大曲必須要經(jīng)過6 個月的貯存、醬香白酒釀造用曲量大的根本原因。3）Aspergillus是大曲富集的優(yōu)勢霉菌，但富集率為負(fù)，對比可培養(yǎng)霉菌數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，曲霉種類繁多，通過平板培養(yǎng)在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)17 種而在大曲中僅發(fā)現(xiàn)了8 種，由此可知，盡管曲霉同時作為大曲和環(huán)境樣品中的優(yōu)勢霉菌，但大曲內(nèi)部條件還是抑制了部分曲霉的生長。

圖6 各主釀區(qū)霉菌由環(huán)境至大曲的遷移率和弦圖分析Fig. 6 Chord diagram analysis of mold migration from environment to Daqu in the main brewing areas

為進(jìn)一步分析各主釀區(qū)環(huán)境中霉菌向大曲的遷移情況，運(yùn)用軟件RStudio繪制各主釀區(qū)霉菌由環(huán)境至大曲的遷移率和弦圖（圖6）。和弦越粗表示各主釀區(qū)環(huán)境霉菌向大曲的遷移率越低（小刻度數(shù)值越大遷移率越低），大刻度數(shù)值越大遷移率越高。由圖6可知，各主釀區(qū)環(huán)境霉菌向大曲的遷移率略有不同（79%～98%），表明大曲中至少79%以上的霉菌來自環(huán)境中霉菌的遷移，而遷移率不同表明在不同環(huán)境中大曲和周圍環(huán)境的交互程度存在差異。結(jié)合2.2節(jié)部分結(jié)論分析，可能由于各主釀區(qū)大曲微生物遷移率的不同，影響了整個大曲微生態(tài)結(jié)構(gòu)，甚至影響了各主釀區(qū)酒體風(fēng)格。

3 結(jié) 論

本課題基于MiSeq平臺采用高通量測序技術(shù)，對茅臺鎮(zhèn)醬香白酒7 個主釀區(qū)釀造大曲和環(huán)境樣品霉菌進(jìn)行解析，共檢出霉菌95 個屬，其中從大曲樣品中檢出68 個屬，環(huán)境樣品中檢出89 個屬。通過對霉菌多樣性結(jié)構(gòu)分析，明確了Aspergillus、Byssochlamys、Monascus、Thermoascus、Thermomyces、Rhizomucor等是醬香白酒釀造大曲中的優(yōu)勢霉菌（相對豐度≥1%）；Alternaria、Aspergillus、Byssochlamys、Cladosporium、Fusicolla、Lecythophora、Monascus、Penicillium、Phoma、Pyrenochaeta、Thermoascus、Thermomyces、Toxicocladosporium等是醬香白酒釀造環(huán)境中的優(yōu)勢霉菌。其中，大曲優(yōu)勢霉菌種類與前人研究重復(fù)率較高，通過功能性分析發(fā)現(xiàn)這些優(yōu)勢霉菌屬有利于發(fā)酵；環(huán)境霉菌多樣性豐富，提供益生菌的同時也存在大量豐度較高的病原菌，還需要復(fù)雜的發(fā)酵過程進(jìn)行篩選。

通過對各主釀區(qū)霉菌差異性分析，發(fā)現(xiàn)各主釀區(qū)霉菌種群結(jié)構(gòu)在大曲樣品中的差異性較高，在環(huán)境樣品中的差異性較低，但7 個主釀區(qū)同時共有的霉菌相似度較高，說明在茅臺鎮(zhèn)穩(wěn)定的微生態(tài)大環(huán)境中，大曲微生物差異性賦予各區(qū)域酒廠酒體不同的風(fēng)格特點；研究發(fā)現(xiàn)區(qū)域2釀造環(huán)境微生態(tài)結(jié)構(gòu)相比其他區(qū)域優(yōu)勢明顯，對提供發(fā)酵動力和提升酒體風(fēng)格具有較大助力，該結(jié)論從微生物角度為酒廠的選址提供了理論依據(jù)；通過對主釀區(qū)生產(chǎn)大曲和釀造環(huán)境中霉菌種群結(jié)構(gòu)差異性分析，發(fā)現(xiàn)大曲在曲房開放式發(fā)酵、貯存過程中與環(huán)境霉菌資源交互作用明顯，但遷移率的不同表明在不同區(qū)域大曲和周圍環(huán)境的交互程度存在差異，這種差異可能對整個大曲微生態(tài)結(jié)構(gòu)甚至各主釀區(qū)酒體風(fēng)格差異產(chǎn)生重要影響。