焦磷酸鈉對(duì)腺嘌呤核苷三磷酸解離氧化肌動(dòng)球蛋白的影響

呂博文，耿曉茜，張?jiān)骆?澤，李春強(qiáng)，邵俊花

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

肌肉具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但是在貯藏和加工過(guò)程中汁液易流失，導(dǎo)致肉制品持水性差、口感粗糙。為了提高產(chǎn)品的多汁性和食用口感，焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，TSPP）、三聚磷酸鈉和六偏磷酸鈉等堿性磷酸鹽常用于肉制品中，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值[1]、增加離子強(qiáng)度[2]、螯合金屬離子[3]、解離肌動(dòng)球蛋白[4]等機(jī)制改善肉制品的品質(zhì)[5-7]。其中TSPP應(yīng)用最為普遍，其關(guān)鍵作用機(jī)制是可以解離肌動(dòng)球蛋白。動(dòng)物屠宰發(fā)生僵直后，由于腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的缺乏，肌肉中的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白以肌動(dòng)球蛋白的形式存在，持水力差。TSPP是ATP的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，且與肌球蛋白頭部S1活性部位中ATP結(jié)合位點(diǎn)相同或相近[8-9]，可將部分肌動(dòng)球蛋白解離為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白[4]。在肉制品加工過(guò)程中，焦磷酸鹽結(jié)合粉碎、混合、滾揉按摩等操作，會(huì)使肌原纖維解體，產(chǎn)生游離的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，持水能力和凝膠能力大大增加，故可提高肉及肉制品的持水性、嫩度和質(zhì)地等品質(zhì)[7,10-11]。而且，在鹽（≥0.4 mmol/L）和TSPP同時(shí)存在時(shí)，肌動(dòng)球蛋白在解離的同時(shí)伴隨著粗絲解聚和肌原纖維膨脹，更多的水分被包裹在肌纖維內(nèi)部，也會(huì)提高肌肉的持水性[12]。一般認(rèn)為，足夠量ATP作用于肌動(dòng)球蛋白時(shí)，會(huì)使其完全解離，但TSPP作用于肌動(dòng)球蛋白會(huì)發(fā)生何種程度的解離尚不清楚。

此外，由于肌肉蛋白富含金屬離子、脂肪和血紅素類(lèi)化合物等促氧化物質(zhì)，在冷凍、貯藏和加工過(guò)程中易被氧化，導(dǎo)致肌肉蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[13]。Li Chunqiang等[14]研究表明，蛋白氧化能夠封閉肌球蛋白頭部S1活性部位中的SH1和SH2（活性巰基），使肌球蛋白頭部S1結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化，影響ATPase活性。而劉澤龍[15]和孫悅等[16]研究表明，1 mmol/L TSPP的加入能夠在一定程度上抑制蛋白氧化。而TSPP對(duì)蛋白氧化的抑制作用是否會(huì)影響ATP的完全解離作用還鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用從豬外脊肉中提取的肌動(dòng)球蛋白為研究對(duì)象，以羥自由基氧化系統(tǒng)為模型，研究TSPP的解離效果及其對(duì)ATP解離不同氧化程度肌動(dòng)球蛋白的影響，旨在為T(mén)SPP在肉制品中應(yīng)用和調(diào)控提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)選取宰后24 h內(nèi)pH 5.5左右的金球牌豬外脊肉作為提取肌動(dòng)球蛋白的原料，購(gòu)買(mǎi)于遼寧沈陽(yáng)興隆大家庭超市，豬品種為大白豬。

6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸、ATP上海麥克林生化科技有限公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、TSPP、NaHCO3、Na2CO3、H2O2、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、鹽酸胍、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、哌嗪-N,N′-(2-乙磺酸)（piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)，PIPES） 美國(guó)GENVIEW生化試劑公司；N-乙基馬來(lái)酰亞胺（N-ethylmaleimide，N-EM） 百靈威科技有限公司；沒(méi)食子酸丙酯（propyl gallate，PG） 上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī) 無(wú)錫沃信儀器有限公司；AUY120電子分析天平 日本島津公司；STARTER2100 pH計(jì) 奧豪斯儀器有限公司；DJ-1磁力攪拌器 常州榮華儀器有限公司；奧氏黏度計(jì) 沈陽(yáng)騰龍玻璃儀器公司；Cary 50紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；5804R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Etsppendorf公司；Zeta Sizer Nano series激光粒度儀 馬爾文儀器有限公司；HT 7700透射電子顯微鏡 日立高新技術(shù)公司；GE-250電泳儀、AI600 UV超靈敏多功能成像儀 美國(guó)通用電氣公司。

1.3 方法

1.3.1 肌動(dòng)球蛋白提取

根據(jù)Perry等[17]的方法，將10 倍體積的Weber溶液（0.6 mol/L KCl、0.01 mol/L Na2CO3、0.04 mol/L NaHCO3）加入豬外脊肉中，采用高速組織搗碎機(jī)以12 000 r/min轉(zhuǎn)速于4 ℃勻漿。將勻漿液密封放入冰盆中，置于磁力攪拌器上低速攪拌24 h后，用100 目絹布過(guò)濾。在濾液中加入蒸餾水，將KCl濃度稀釋到0.2 mol/L，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，所得沉淀中加入0.2 mol/L KCl溶液于4 ℃、12 000 r/min勻漿，12 000 r/min離心20 min，沉淀即為肌動(dòng)球蛋白。提取出來(lái)的肌動(dòng)球蛋白密封放在4 ℃冰箱中，18 h內(nèi)用完。蛋白濃度采用雙縮脲法測(cè)定[18]，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.2 肌動(dòng)球蛋白TSPP處理

5 mg/mL肌動(dòng)球蛋白分散于含有1 mmol/L TSPP、2 mmol/L MgCl2、0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES緩沖液（pH 6.25）中，于4 ℃反應(yīng)2 h。未加TSPP和MgCl2的蛋白溶液作為空白對(duì)照。

1.3.3 肌動(dòng)球蛋白氧化處理

經(jīng)TSPP處理（＋TSPP）和未經(jīng)TSPP處理（-TSPP）的肌動(dòng)球蛋白溶液（5 mg/mL）中，添加Fenton試劑（0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mmol/L抗壞血酸，1、5、10、20 mmol/L H2O2）于4 ℃氧化2 h，添加PG、Trolox和EDTA-2Na（終濃度各1 mmol/L）終止氧化反應(yīng)。不加氧化劑（FeCl3/抗壞血酸/H2O2）且在相同條件下處理的蛋白作為空白對(duì)照。

1.3.4 羰基含量測(cè)定

將5 mg/mL肌動(dòng)球蛋白溶液與含10 mmol/L DNPH的2 mol/L HCl溶液以1∶5的比例混合，按照Levine等[19]的方法測(cè)定羰基含量。反應(yīng)后的樣品在370 nm波長(zhǎng)處測(cè)定羰基含量，280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定蛋白含量，用摩爾吸光系數(shù)為22 000 L/（mol·cm）計(jì)算羰基含量。

1.3.5 總巰基含量測(cè)定

肌動(dòng)球蛋白用含0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES緩沖液（pH 6.25）稀釋為2 mg/mL，根據(jù)Liu等[20]的DTNB法測(cè)定總巰基含量。反應(yīng)后的樣品于412 nm波長(zhǎng)讀數(shù)，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計(jì)算巰基含量。

1.3.6 完全解離處理

將TSPP和氧化處理的肌動(dòng)球蛋白分散于含有5 mmol/L ATP、0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES緩沖液（pH 6.25）中使其完全解離，未加ATP的蛋白溶液作空白對(duì)照。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參考Li Chunqiang[21]的方法并稍加改動(dòng)。采用12%分離膠和5%濃縮膠分析TSPP、氧化處理后肌動(dòng)球蛋白的聚集變化。4 mg/mL樣品與等體積含或不含10%β-ME的上樣緩沖液混合，置于沸水中煮沸3 min，每孔進(jìn)樣量為20 μg蛋白。電泳凝膠用含1 mg/mL考馬斯亮蘭R250、50%甲醇和6.8%冰乙酸的溶液染色40 min，隨后用含5%甲醇和7.5%冰乙酸的脫色液脫色過(guò)夜。脫色后的膠片拍照，并用自帶軟件對(duì)條帶密度進(jìn)行分析。

1.3.8 黏度的測(cè)定

為了解TSPP對(duì)不同氧化程度的肌動(dòng)球蛋白解離情況的影響，根據(jù)Granicher等[22]采用黏度法（特性黏數(shù)）反映此過(guò)程的變化趨勢(shì)。將1.5 mg/mL蛋白加入到奧氏黏度計(jì)中，豎直放置黏度計(jì)并記錄不同處理的蛋白溶液的流出時(shí)間。特性黏數(shù)的計(jì)算公式如下：

式中：ηref為相對(duì)黏度（無(wú)量綱）；t和ρ分別為肌動(dòng)球蛋白的流出時(shí)間和密度；t0和ρ0分別為溶劑的流出時(shí)間和密度；c為蛋白質(zhì)量濃度/（g/dL）。

1.3.9 粒徑分布測(cè)定

1.5 mg/mL肌動(dòng)球蛋白樣品分散于含有0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L PIPES緩沖液（pH 6.25）中，分別使用激光粒度儀測(cè)量不同條件下處理樣品的粒徑分布，其中激光波長(zhǎng)為633 nm，散射光強(qiáng)檢測(cè)器角度為173°。結(jié)果用3 次測(cè)定的平均粒徑表示[23]。

1.3.10 肌動(dòng)球蛋白形態(tài)觀察

將0.1 mg/mL肌動(dòng)球蛋白直接滴在銅網(wǎng)上，另滴加一滴負(fù)染液（2%磷鎢酸）染色10 min。采用透射電子顯微鏡觀察肌動(dòng)球蛋白的形態(tài)變化，加速電壓采用100 kV[24]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均為至少3 次重復(fù)的平均值。使用Statistix 9軟件進(jìn)行方差分析和顯著性分析（最小顯著性差異法），定量分析統(tǒng)計(jì)圖使用Origin 8.5繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSPP對(duì)肌動(dòng)球蛋白氧化程度的影響

2.1.1 羰基含量

有研究表明，蛋白氧化會(huì)引起氨基酸側(cè)鏈修飾和肽鏈斷裂，均生成羰基衍生物，所以羰基是描述蛋白氧化程度的標(biāo)志物之一[13]。如圖1所示，對(duì)于-TSPP樣品，羰基含量隨著H2O2濃度的升高而顯著升高（P＜0.05）。當(dāng)H2O2濃度為20 mmol/L時(shí)，羰基含量是未氧化蛋白的4 倍左右。雖然在相同氧化程度下＋TSPP樣品與-TSPP樣品的羰基含量差異不顯著（P＞0.05），但是-TSPP樣品在未氧化和1 mmol/L H2O2時(shí)均比＋TSPP樣品的羰基含量稍高，并且經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均得到同樣結(jié)果，這說(shuō)明在1 mmol/L H2O2條件下，TSPP能抑制羰基衍生物的生成。然而，在H2O2濃度大于5 mmol/L時(shí)，＋TSPP樣品的羰基含量稍高，但與-TSPP樣品的蛋白羰基含量沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），說(shuō)明TSPP并不能抑制肌動(dòng)球蛋白中羰基的生成。

圖1 TSPP對(duì)肌動(dòng)球蛋白羰基含量的影響Fig. 1 Effect of TSPP on carbonyl content of actomyosin

2.1.2 巰基含量

肌動(dòng)球蛋白是由肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白組成的，而每個(gè)肌動(dòng)蛋白中大約含有5 個(gè)巰基，每個(gè)肌球蛋白中大約含有40 個(gè)巰基，并且這些巰基易受羥自由基的攻擊而轉(zhuǎn)換成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，從而導(dǎo)致蛋白氧化發(fā)生交聯(lián)[25-26]。因此，巰基含量的變化可以直接反映肌動(dòng)球蛋白的氧化程度。由圖2所示，巰基含量隨著H2O2濃度增大而顯著降低（P＜0.05）。-TSPP樣品和＋TSPP樣品在未氧化時(shí)巰基含量分別為52.07 μmol/g和54.81 μmol/g，當(dāng)H2O2濃度為5 mmol/L時(shí)，巰基含量分別下降了56.54%和47.27%，當(dāng)H2O2濃度升高至20 mmol/L時(shí)，巰基含量分別下降了84.82%和84.36%，說(shuō)明1～5 mmol/L H2O2時(shí)，TSPP對(duì)肌動(dòng)球蛋白中巰基的氧化起到一定的保護(hù)作用，而10～20 mmol/L H2O2時(shí)保護(hù)作用不明顯。

圖2 TSPP對(duì)肌動(dòng)球蛋白巰基含量的影響Fig. 2 Effect of TSPP on sulfydryl content of actomyosin

2.1.3 SDS-PAGE分析

圖3 TSPP處理后肌動(dòng)球蛋白的SDS-PAGE模式Fig. 3 SDS-PAGE patterns of actomyosin treated with TSPP

如圖3a所示，與未氧化樣品相比，隨著H2O2濃度的增加，-TSPP樣品和＋TSPP樣品中的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）和肌動(dòng)蛋白均逐漸降低，當(dāng)H2O2濃度增加到20 mmol/L時(shí)，MHC幾乎完全消失，肌動(dòng)蛋白條帶也明顯減少。但是隨著氧化程度的增加，相對(duì)于未氧化的MHC和肌動(dòng)蛋白，MHC條帶減少幅度遠(yuǎn)大于肌動(dòng)蛋白，說(shuō)明肌球蛋白比肌動(dòng)蛋白更易于氧化，與Li Chunqiang等[21]結(jié)果相符。這說(shuō)明，肌動(dòng)球蛋白氧化時(shí)，主要是其中的肌球蛋白發(fā)生氧化。在肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白條帶減少的同時(shí)，在濃縮膠上部出現(xiàn)大分子聚合物，但加入還原劑β-ME后，幾乎所有聚集體都消失，同時(shí)減少的MHC和肌動(dòng)蛋白大部分恢復(fù)，說(shuō)明這些大分子聚集體主要是通過(guò)二硫鍵形成的。Xiong[26]和Li Chunqiang[21]等指出羥自由基攻擊肌球蛋白時(shí)，二硫鍵主要通過(guò)肌球蛋白尾部-尾部模式進(jìn)行交聯(lián)。然而，肌動(dòng)蛋白中二硫鍵交聯(lián)模式研究較少，目前尚不明確。

利用AI600超靈敏多功能成像儀對(duì)圖3a、c中的MHC和肌動(dòng)蛋白條帶進(jìn)行掃描，獲得條帶密度，如圖4所示。對(duì)于未氧化蛋白，＋TSPP和-TSPP樣品的MHC條帶密度之間沒(méi)有明顯差異。在H2O2濃度1 mmol/L時(shí)，＋TSPP樣品的MHC條帶密度明顯高于-TSPP樣品，說(shuō)明TSPP對(duì)MHC的氧化具有較好的抑制作用。然而，當(dāng)H2O2濃度為10～20 mmol/L時(shí)，＋TSPP樣品的MHC條帶密度只是稍高于-TSPP樣品，對(duì)MHC氧化的抑制作用不明顯。

圖4 TSPP對(duì)MHC條帶密度的影響Fig. 4 Effect of TSPP on the density of MHC band

當(dāng)受到羥自由基攻擊時(shí)，肌肉蛋白會(huì)發(fā)生多種變化，如氨基酸修飾、肽鏈斷裂和蛋白交聯(lián)等[13]，故TSPP對(duì)肌動(dòng)球蛋白氧化的影響需要根據(jù)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合判定。綜合分析羰基、巰基和SDS-PAGE結(jié)果可以看出，在H2O2濃度為1 mmol/L時(shí)，TSPP抑制肌動(dòng)球蛋白的氧化；而H2O2濃度為5～20 mmol/L時(shí)，TSPP對(duì)肌動(dòng)球蛋白的氧化無(wú)抑制作用。劉澤龍[15]研究發(fā)現(xiàn)，在0.01 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗壞血酸和0.5 mmol/L H2O2條件氧化肌球蛋白，TSPP對(duì)肌球蛋白頭部S1和S2頸部起到保護(hù)作用，減弱羥自由基攻擊作用。這說(shuō)明在一定氧化條件下，TSPP對(duì)肌肉蛋白確實(shí)存在一定的氧化保護(hù)作用。

2.2 TSPP對(duì)ATP解離作用的影響

2.2.1 黏度

圖5 TSPP和ATP相繼處理后肌動(dòng)球蛋白特性黏數(shù)的變化Fig. 5 Changes in intrinsic viscosity of actomyosin after being treated with TSPP and then completely dissociated with ATP

如圖5所示，相對(duì)于其他3 組樣品（＋TSPP、-ATP；-TSPP、＋ATP；＋TSPP、＋ATP），未經(jīng)TSPP和ATP處理（-TSPP、-ATP）樣品的特性黏數(shù)最大，為1.10～1.29 dL/g，說(shuō)明該組樣品的黏度最大，隨著H2O2濃度的增加，-TSPP、-ATP樣品的特性黏數(shù)出現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，但是差異并不顯著（P＞0.05），說(shuō)明蛋白氧化對(duì)黏度影響不大。在TSPP條件下，肌動(dòng)球蛋白的特性黏數(shù)顯著下降（P＜0.05），鑒于氧化對(duì)肌動(dòng)球蛋白的黏度影響不大，推測(cè)黏度顯著下降是由肌動(dòng)球蛋白發(fā)生部分解離[4]引起的。當(dāng)加入ATP后，不管是否經(jīng)過(guò)TSPP處理，特性黏數(shù)均繼續(xù)下降，說(shuō)明肌動(dòng)球蛋白發(fā)生進(jìn)一步的解離，但是＋TSPP肌動(dòng)球蛋白的特性黏數(shù)卻稍高于-TSPP肌動(dòng)球蛋白，說(shuō)明TSPP的加入不利于ATP的解離作用，一種推測(cè)可能是由于焦磷酸鹽的結(jié)合位點(diǎn)與ATP的結(jié)合位點(diǎn)相同，存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。有研究表明，焦磷酸鹽和ATP在肌球蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)相同或相近[8-9]，而本研究證明二者的結(jié)合位點(diǎn)是相同的。另一種推測(cè)可能是由于焦磷酸鹽結(jié)合到肌球蛋白頭部S1后，改變了ATP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，從而影響ATP的解離作用。對(duì)于未氧化肌動(dòng)球蛋白，TSPP和ATP單獨(dú)作用下特性黏數(shù)分別下降了30.4%和41.9%，說(shuō)明TSPP解離效果是ATP的72.6%，表明焦磷酸鹽可使大部分肌動(dòng)球蛋白解離，但仍有部分肌動(dòng)球蛋白無(wú)法解離。

為了排除氧化自身對(duì)特性黏數(shù)的影響，以-TSPP、-ATP樣品為對(duì)照，計(jì)算-TSPP、＋ATP和＋TSPP、＋ATP樣品中由ATP解離引起的相對(duì)黏數(shù)變化量。如圖5所示，在-TSPP和＋TSPP條件下，氧化樣品的相對(duì)黏數(shù)變化量幾乎都稍高于未氧化樣品。而且，隨著氧化程度的增加，-TSPP和＋TSPP樣品的相對(duì)黏數(shù)變化量均先上升后下降，在H2O2濃度1 mmol/L時(shí)相對(duì)黏數(shù)變化量最大。雖然1 mmol/L H2O2樣品與其他氧化程度樣品的相對(duì)黏數(shù)變化量差異不顯著，但是在每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)此趨勢(shì)，說(shuō)明無(wú)論是否存在TSPP，適度蛋白氧化都有利于ATP的解離作用，且氧化程度與TSPP和ATP的解離作用之間確實(shí)存在一定關(guān)系，推測(cè)可能是氧化修飾改變了肌球蛋白頭部與肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的化學(xué)變化，也可能是氧化引起的蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)更有利于ATP接近解離結(jié)合位點(diǎn)。劉澤龍[15]在低鹽（0.1 mol/L）條件下利用1 mmol/L H2O2羥自由基氧化系統(tǒng)氧化5 mg/mL肌動(dòng)球蛋白6 h和12 h，采用與本實(shí)驗(yàn)相同的方法測(cè)定黏度，發(fā)現(xiàn)氧化對(duì)ATP的解離作用沒(méi)有顯著影響，但若觀察相對(duì)黏數(shù)變化量，可以看出氧化樣品的相對(duì)黏數(shù)變化量明顯小于未氧化樣品，跟本研究得到的結(jié)果有一些差異。分析這2 種結(jié)果的差異，推測(cè)與鹽濃度有關(guān)，因?yàn)榧≡w維在低鹽和高鹽時(shí)，結(jié)構(gòu)存在很大差異，例如高鹽更有利于肌原纖維膨脹和肌球蛋白的溶出[12,27]、增加肌原纖維靜電斥力等[28]，可能會(huì)弱化ATP與肌球蛋白頭部的結(jié)合。

2.2.2 平均粒徑

圖6 TSPP和ATP相繼處理后肌動(dòng)球蛋白平均粒徑的變化Fig. 6 Changes in average particle size of actomyosin after being treated with TSPP and then completely dissociated with ATP

由于肌動(dòng)球蛋白解離生成肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，粒徑會(huì)隨解離進(jìn)行而發(fā)生改變，所以可通過(guò)測(cè)量平均粒徑評(píng)判解離程度的高低[15]。TSPP和ATP處理后，不同氧化程度肌動(dòng)球蛋白的平均粒徑變化如圖6所示。可以看出，-TSPP、-ATP肌動(dòng)球蛋白的平均粒徑最大。TSPP處理后，肌動(dòng)球蛋白的平均粒徑均顯著減?。≒＜0.05），說(shuō)明部分肌動(dòng)球蛋白在TSPP作用下解離為肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，導(dǎo)致平均粒徑變小。加入ATP后，平均粒徑進(jìn)一步顯著減小（P＜0.05），說(shuō)明肌動(dòng)球蛋白進(jìn)一步發(fā)生解離，但是＋TSPP、＋ATP肌動(dòng)球蛋白的平均粒徑卻高于-TSPP、＋ATP肌動(dòng)球蛋白，間接說(shuō)明TSPP的加入不利于ATP的解離作用。TSPP和ATP單獨(dú)作用時(shí)，未氧化肌動(dòng)球蛋白的平均粒徑分別下降了21.2%和48.4%，TSPP處理樣品平均粒徑的下降幅度是ATP處理樣品的43.8%。對(duì)于4 組樣品（-TSPP、-ATP；＋TSPP、-ATP；-TSPP、＋ATP；＋TSPP、＋ATP），每一組樣品隨H2O2濃度的變化差異均不顯著，說(shuō)明TSPP和ATP對(duì)粒徑的影響遠(yuǎn)大于蛋白氧化。總體來(lái)看，平均粒徑和黏度的變化趨勢(shì)非常相似，進(jìn)一步印證了TSPP和ATP的解離作用。

2.2.3 微觀結(jié)構(gòu)

應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察TSPP及ATP處理后不同氧化程度的肌動(dòng)球蛋白的解離情況，如圖7所示。未經(jīng)TSPP和ATP處理時(shí)，未氧化的肌動(dòng)球蛋白呈較長(zhǎng)的纖維狀，此時(shí)肌球蛋白頭部與絲狀結(jié)構(gòu)的F-肌動(dòng)蛋白[29]呈結(jié)合狀態(tài)。單獨(dú)加入TSPP或ATP后，肌動(dòng)球蛋白解離，導(dǎo)致蛋白的結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，生成較短的纖維簇，而且＋ATP樣品中蛋白纖維長(zhǎng)度比＋TSPP樣品更短，說(shuō)明ATP解離效果更好。此外，還可以看出相對(duì)于單獨(dú)＋TSPP樣品，單獨(dú)＋ATP樣品中出現(xiàn)更多離散的纖維結(jié)。張軍等[30]報(bào)道在含有2 mmol/L MgCl2、100 mmol/L KCl、1 mmol/L DTT和1 mmol/L ATP的5 mmol/L Tris-Cl緩沖液（pH 7.5）中及沒(méi)有微絲穩(wěn)定劑（鬼筆環(huán)肽）存在的條件下，肌動(dòng)蛋白微絲之間會(huì)相互纏繞或者形成多級(jí)螺旋的纖維結(jié)構(gòu)，自組裝成離散的、大尺度的復(fù)雜聚集結(jié)構(gòu)。在TSPP處理樣品中加入ATP，可以看出肌動(dòng)球蛋白解離效果不如單獨(dú)使用ATP，存在一些稍長(zhǎng)的纖維，這與圖5和圖6結(jié)果相符，說(shuō)明TSPP的加入反而會(huì)在一定程度上抑制ATP的解離效果。

圖7 TSPP和ATP相繼處理后肌動(dòng)球蛋白形態(tài)變化Fig. 7 Morphological changes of actomyosin after being treated with TSPP and then completely dissociated with ATP

4 組樣品（-TSPP、-ATP；＋TSPP、-ATP；-TSPP、＋ATP；＋TSPP、＋ATP），隨著H2O2濃度的增加，均發(fā)生蛋白聚集現(xiàn)象。對(duì)于-TSPP、-ATP樣品，當(dāng)H2O2濃度為1 mmol/L時(shí)，纖維狀的肌動(dòng)球蛋白聚集成空洞比較疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；當(dāng)H2O2濃度繼續(xù)增加為20 mmol/L時(shí)，疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，大量肌動(dòng)球蛋白聚集成致密的蛋白團(tuán)塊。對(duì)于其他3 組解離樣品（＋TSPP、-ATP；-TSPP、＋ATP；＋TSPP、＋ATP），由于肌動(dòng)球蛋白解離成肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，雖然氧化程度增加，但是蛋白聚集程度比-TSPP、-ATP樣品弱，結(jié)構(gòu)較松散?？傮w來(lái)說(shuō)，3 組樣品的聚集程度由強(qiáng)到弱依次是：＋TSPP、-ATP＞＋TSPP、＋ATP＞-TSPP、＋ATP。其中＋TSPP、-ATP和＋TSPP、＋ATP樣品中存在不同程度的蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而-TSPP、＋ATP樣品中幾乎很少有密集的網(wǎng)絡(luò)狀蛋白聚集結(jié)構(gòu)，這應(yīng)該是因?yàn)? 種處理?xiàng)l件下，肌動(dòng)球蛋白解離程度不同所致。

3 結(jié) 論

適度氧化（例如1 mmol/L H2O2Fenton試劑氧化2 h）時(shí)，TSPP對(duì)肌動(dòng)球蛋白的氧化起到一定的抑制作用，而氧化程度加深時(shí)（例如20 mmol/L H2O2），TSPP的抑制作用不明顯。蛋白氧化在某種程度上有利于ATP的解離作用，然而，這種作用會(huì)被TSPP弱化，可能與TSPP與ATP結(jié)合位點(diǎn)相同有關(guān)。利用TSPP可使大部分肌動(dòng)球蛋白解離的性質(zhì)，結(jié)合滾揉腌制可提高肌肉的嫩度。然而，TSPP處理后，仍有部分蛋白無(wú)法解離。當(dāng)遭受氧化時(shí)，未解離的肌動(dòng)球蛋白仍會(huì)形成大的蛋白聚集物，不利于肌肉嫩度的提高。此外，由于肉制品加工（例如滾揉按摩、斬拌）時(shí)肌肉蛋白不可避免的發(fā)生氧化，且氧化形成的蛋白聚集物對(duì)肌肉蛋白在脂肪表面的分布及蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成均有一定影響，故TSPP處理對(duì)肉制品品質(zhì)（如質(zhì)地、嫩度和多汁性等）的提高作用并不能達(dá)到最佳效果。因此，有必要進(jìn)一步研究提高TSPP解離效果的方法及措施。