食物致敏原表位定位技術的研究進展

胡永芯，李 欣，程劍鋒，馬 鑫，孟軒夷，陳紅兵，武 涌,

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330047；3.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047）

近年來，隨著食物的多樣化以及人們生活方式的改變，在澳大利亞、美國、英國、中國等國家的調查均顯示食物過敏發(fā)生率呈現上升趨勢[1]。經世界衛(wèi)生組織與聯合國糧食及農業(yè)組織認定的主要過敏食物包括牛乳、雞蛋、花生、魚、甲殼類水產動物、大豆、小麥和堅果。在發(fā)達國家大約有3%的成年人和8%的兒童患有食物過敏，在美國，2.4%的兒童對多種食物過敏[2]。歐洲一項志愿者自述性調查顯示，食物過敏發(fā)病率為6%[3]。

食物致敏原是引起食物過敏的元兇，指在食物中能被特異性免疫細胞識別并引發(fā)免疫應答的成分?？乖肿优c抗體反應或被抗原受體識別，并引發(fā)機體免疫應答的特殊化學基團稱為表位，即抗原決定簇。表位按照氨基酸的組成結構特點分為線性表位和構象性表位。線性表位也稱順序表位或連續(xù)表位，是氨基酸殘基線性排列組成的表位。構象性表位也稱不連續(xù)表位，是氨基酸殘基在空間相互靠近時形成的能被免疫活性物質識別的特定三維結構。按照表位受體的不同可分為T細胞表位與B細胞表位。T細胞抗原受體（T-cell receptor，TCR）只識別經過抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）處理，并以肽-主要組織相容性復合體（peptide-major histocompatibility complex，pMHC）形式呈現于細胞膜表面的表位，由于抗原的空間構象在抗原提呈、加工過程中多被破壞，因此T細胞表位都是線性表位。而B細胞抗原受體（B-cell receptor，BCR）具有識別完整抗原的能力，因此B細胞表位既有構象性表位也有線性表位。食物致敏原的B細胞表位大多是蛋白質表位，鮮少有關于碳水化合物表位的報道[4]。

1 T細胞表位

1.1 T細胞表位的類型

T細胞表位指特定抗原經過APC處理后，結合至少一個MHC分子并以pMHC復合物形式在APC表面表達，能被T細胞受體識別并觸發(fā)T細胞免疫應答的肽[5]。T細胞表位都是線性表位，不能與免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）結合。pMHC復合物的形成有MHC I類和MHC II類兩種途徑，分別被CD8+和CD4+T細胞識別。來自細胞外的抗原稱為外源性抗原，如食物致敏原，其經APC加工后與MHC II類分子形成的復合物被CD4+T細胞的TCR識別。MHC II類分子結合長度為10～30 個氨基酸殘基的肽段，最佳長度為12～16 個氨基酸[6]。CD4+T細胞在食物過敏的引發(fā)和維持中起關鍵作用[7]。

1.2 T細胞表位的定位方法

目前，T細胞表位的定位方法發(fā)展迅速，包括細胞毒性T細胞抗原表位的預測和輔助性T細胞（helper T cell，Th）抗原表位的預測。研究表明，pMHC II類復合物與TCR的結合是初始CD4+T細胞分化為促炎Th2的關鍵[8]。Th2能產生白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13等細胞因子，IL-4、IL-13能促進IgE生成，IL-4和IL-5分別在嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞的募集和啟動中起重要作用[9]。Th2和其他T細胞亞群在過敏反應中的病理作用以及誘導耐受性作用在過去的幾十年里已經成為一個研究熱點。目前對于食物致敏原T細胞表位的研究較為廣泛，可采用T細胞增殖實驗[10-11]、四聚體引導表位作圖法[12]、免疫信息學預測法等進行表位鑒定。

1.2.1 T細胞增殖實驗

正常人體內的Th1/Th2存在平衡，當機體發(fā)生過敏反應時，此平衡被打破。因此T細胞表位可通過T細胞增殖相關的細胞因子變化來確定。首先合成包含全部蛋白質序列的重疊多肽，一般長度為15～20 個氨基酸，重疊3～5 個氨基酸[13]，然后將合成肽刺激T細胞后檢測T細胞增殖情況，由此可確定T細胞表位。由于過敏患者外周血單核細胞中抗原特異性CD4+T細胞的數量較少，很難觀察到明顯的增殖情況，比如花生過敏患者的Ara h 1特異性T細胞的含量為百萬分之九，即每1 000 000 個T細胞中只有9 個Ara h 1特異性T細胞[14]。目前大多數研究使用的是外周血單核細胞中分離培養(yǎng)的T細胞系（T-cell line，TCL）或T細胞克隆。T細胞增殖情況的檢測可采用熒光染色和酶聯免疫斑點實驗（enzyme-linked immunospot，ELISPOT）等方法。熒光染色法通過流式細胞儀檢測細胞的熒光強度來觀察細胞分裂增殖的情況，可與其他啟動標記物組合使用，但大量旁觀者T細胞（bystander T cells）會影響結果[15-16]。ELISPOT通過特異性抗體捕獲細胞分泌的細胞因子，再利用顯色法展示結果來檢測單個細胞的分泌情況，最終確定能刺激T細胞增殖的表位[17]。

T細胞增殖法在食物致敏原T細胞表位定位中的運用非常廣泛，這些食物包括巴西堅果、桃子、花生[18]、蝦[19]、牛奶[20]等。Wai等在一項定位‘刀額新對蝦’的免疫優(yōu)勢T細胞表位研究中，合成了18 個長度為20 個氨基酸、重疊5 個氨基酸的包含Met e 1全部序列的重疊肽，使用重疊肽刺激從Met e 1致敏的BALB/c小鼠分離出的脾細胞并檢測刺激后的細胞因子變化，最終鑒定出6 個主要的Met e 1 T細胞表位[19]。Gouw等利用MHC II結合法識別出人類白細胞抗原-DRB1（human leucocyte antigen-DRB1，HLA-DRBI）限制肽，并通過人類TCL的增殖情況鑒定出13 個長度為9 個氨基酸的β-乳球蛋白的肽段，證明合成肽段能被牛乳蛋白特異性TCL識別并誘導T細胞增殖[20]。

1.2.2 四聚體引導表位作圖法

四聚體引導表位作圖（tetramer-guided epitope mapping，TGEM）是一種免疫學技術，利用肽和HLA II類的四聚體和染色試劑，通過肽段篩選程序快速識別致敏表位[21]。運用TGEM的兩個前提是已知個體的HLA表現型和抗原的重疊肽庫[22]。TCR與pMHC之間的相互作用較弱，通常僅持續(xù)幾秒鐘，但可溶性pMHC形成四聚體后，會延長相互作用的半衰期[23]。首先，可溶性MHC II類單體與肽段的羧基端連接，通過熒光標記的鏈霉親和素組裝成能被特異性TCR識別的pMHC四聚體。然后四聚體與CD4+T細胞或外周血單核細胞中的APC相互作用，使CD4+T細胞也被染色，通過流式細胞術分選陽性染色T細胞克隆，使致敏原特異性T細胞得以回收。最后將陽性染色的肽段分別加載到MHC II類單體上，重復染色[22]。TGEM法特異性和靈敏性高，但價格昂貴，一般需要使用患者血清進行體外驗證實驗。TGEM法可以與多種技術同時使用，如同時對MHC四聚體和胞內細胞因子進行染色是一種研究表位特異性CD4+T細胞的優(yōu)化方案[24-25]。但許多HLA II類分子不容易被分離，限制了TGEM法的應用[26]。

Delong等利用HLA II類分子與花生致敏原Ara h 1肽形成的特異性四聚體測定Ara h 1反應性T細胞的水平、表型和細胞因子譜[14]。有研究者采用TGEM法鑒定出核桃致敏原Jug r 2的多個CD4+T細胞表位并構建了Jug r 2特異性T細胞克隆系[27]。Archila等利用TGEM法鑒定了幾個Ana o 1和Ana o 2衍生的表位，并測定了腰果特異性T細胞的表型和功能，明確了過敏患者具有顯著的Th2表型，接著采用四聚體染色技術和T細胞增殖實驗探究Ana o 1和Ana o 2的特異性T細胞克隆對其他種類堅果的交叉反應活性[28]。

1.2.3 免疫信息學預測法

免疫信息學是生物信息學的一個新分支，可用于預測T細胞表位。T細胞表位與MHC分子形成pMHC復合物后才能被識別，肽和MHC分子之間的親和力與肽段免疫原性有很強的相關性[29]，故可通過pMHC復合物的親和力來間接預測表位，稱為MHC分子親和肽預測法，可分為基于結構和數據兩類[30]?；诮Y構法通常先建立pMHC結構模型，再通過分子動力學模擬、加權直方圖分析等方法評估pMHC II類復合物的結合親和力[31-32]。此法優(yōu)勢在于不需要進行實驗操作，但計算量龐大且比基于數據法的準確性低，在篩選大型蛋白中的應用受到限制[33-34]。數據法是基于MHC分子與已知序列多肽的結合強度來預測T細胞表位。多肽序列一般來源于IEDB[35]、EPIMHC[36]、AntiJen[37]等表位數據庫。肽段與MHC分子的親和力強弱通過與結合親和力閾值對比確定，結合親和力閾值指肽段的半最大抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），即MHC結合到一半時肽段的濃度。一般IC50小于50 nmol/L為強親和力，IC50小于500 nmol/L為弱親和力[5]。

MHC分子親和肽預測中廣泛運用到機器學習算法，如支持向量機（support vector machines，SVM）、特定位置評分矩陣（position-specific scoring matrices，PSSM）、人工神經網絡（artificial neural networks，ANN）和隱馬爾科夫模型（hidden Markov models，HMM）等?；跈C器算法來預測CD4+T細胞表位的網絡服務器有NetMHC II[38]、NetMHC IIpan[39]、TEPITOPE[40]、 TEPITOPEpan[41]、 ProPred[42]、RANKPEP[43]和SVRMHC[44]等，具體如表1所示。

其中，NetMHC II和NetMHC IIpan目前被認為是預測肽段與MHC II類分子結合親和力的最佳途徑[45-46]，兩者的主要區(qū)別在于預測MHC范圍不同。NetMHC II是每個MHC分子獨立網絡的集合，只能預測候選庫里的肽段與MHC分子的結合親和力。而NetMHC IIpan包含一個單一的通用網絡，可以預測已知蛋白序列的肽和所有MHC分子的結合親和力[38]。后者運用范圍更加廣泛，如HLA有上百種I類（HLA I）和II類（HLA II）分子的等位變異，其會結合不同的肽，通過輸入親和力數據到NetMHC IIpan來預測未鑒定的HLA與肽的結合親和力[47-48]。

以花生致敏原表位為例，Pascal等利用NetMHC IIpan-2.0和NetMHC II-2.2算法預測Ara h 1和Ara h 2肽與MHC II類分子的結合位點，鑒定出Ara h 2的4 種能誘導Th2細胞因子產生的優(yōu)勢肽，分別是氨基酸1～4、氨基酸5～9、氨基酸17～22和氨基酸24～27，特別地，氨基酸1～3、氨基酸19～21和氨基酸25～26被預測為強結合[49]。Ramesh等通過使用此測定法預測了Ara h 1的36 種肽段并確定了4 種可用于研發(fā)疫苗的Ara h 1候選肽[50]。

2 B細胞表位

2.1 B細胞表位的類型

B細胞受體或B細胞分泌的特異性抗體識別的表位均稱為B細胞表位，可分為線性表位與構象性表位：線性表位是由一些序列連續(xù)的氨基酸殘基通過肽鍵形成的多肽；構象性表位由在序列上不連續(xù)，通過多肽鏈折疊在空間上相互接近的氨基酸殘基或肽段組成。據報道，90%的B細胞表位是構象性的，在分析了來自AbDb數據庫的488 個抗原-抗體復合物后，發(fā)現可能只有4%的表位是線性表位[51]。線性表位與構象性表位并非完全獨立，某些線性表位是構象性表位的組成部分。在食物過敏中，構象性表位發(fā)揮作用較少，因為食物致敏原通常會受到熱加工變性和胃腸道消化的影響，從而使構象性表位被破壞[52]。B細胞構象性表位相對線性表位更復雜，因此預測B細胞構象性表位更困難，許多方法都很難將抗體與構象性表位的相互作用展示出來。對構象性表位的表征需要復雜的技術，例如合成肽技術、噬菌體展示技術、X射線晶體學、質譜法、氨基酸定點突變和嵌合蛋白法等。

2.2 B細胞表位的定位方法

2.2.1 合成肽技術

合成肽法是研究B細胞線性表位的常見方法，成功率較高且操作簡單。首先在蛋白質數據庫中獲得目標蛋白的氨基酸序列，再合成一系列包含整個氨基酸序列的末端相互重疊的肽段，每段都對應蛋白抗原線狀序列中的一小段。肽鏈長度一般為15～20 個氨基酸，重疊氨基酸的數量根據肽鏈長度和實驗設計確定，也可預先進行表位預測或基因片段分析，用于指導合成表位候選區(qū)肽段[53]。合成肽法與氨基酸替代法結合可用于鑒定抗原表位的關鍵氨基酸殘基，其中丙氨酸常作為替代氨基酸[54]，也有其他氨基酸作為替代，如甘氨酸等，這取決于設計目的。多肽合成后要驗證肽段的純度和序列，可采用反相高效液相色譜法和質譜法。通常選用硝化纖維膜作為合成肽的固體載體，通過合成肽段與患者血清進行特異性免疫反應來確定表位。近年來，多肽微陣列芯片法已被開發(fā)出來，即采用微量點樣的方法將多肽有序固定在載玻片表面，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子反應，通過特定的儀器進行快速、并行、高效地檢測分析。多肽微陣列芯片技術只消耗微升量的血清，卻能同時測定數千個靶點，大大降低了測定單個生物學樣品的成本，促進了表位的高通量篩選，并且獲得的數據也很可靠，但只能定位線性表位，不能用于探究構象性表位。隨著多肽微陣列芯片技術的發(fā)展，現在其已成為高通量識別線性表位和診斷食物過敏的有力工具[55]。

Shreffler等首次使用基于肽微陣列的免疫分析方法繪制花生表位[56]。目前利用多肽芯片技術已經確定了一些可作為候選生物標記物的多肽，用于食物過敏早期診斷和預測其嚴重程度或耐受性建立[57]，如牛乳中的3 種酪蛋白和β-乳球蛋白[58]。Lin Jing等開發(fā)和優(yōu)化了一種可靠、靈敏的多肽微陣列免疫分析方法，并應用于多種食品致敏原IgE表位的標測，已成功地繪制了一系列食物致敏原的抗原表位，如花生/樹堅果、牛奶、蝦、大豆等[59]。Cerecedo等基于多肽微陣列的免疫測定對牛乳中酪蛋白的IgE和IgG4結合表位進行了定位，獲得了αs2-酪蛋白的7 個表位、κ-酪蛋白的4 個表位和β-酪蛋白的2 個表位[60]。Otsu等通過多肽微陣列技術鑒定了Ara h 2的IgE線性表位，并與Ara h 2進行比較，發(fā)現臨床癥狀更嚴重患者的血清IgE識別更少的Ara h 2和Ara h 6線性表位[61]。

2.2.2 噬菌體展示技術

噬菌體展示技術是一種從隨機多肽庫中篩選表位的技術。通過篩選噬菌體展示肽庫或化學合成的組合多肽庫得到的表位通常稱為模擬表位，包含線性表位和構象性表位[62]。噬菌體展示系統(tǒng)的原理是將外源目的編碼基因插入到噬菌體衣殼蛋白基因中，使噬菌體衣殼蛋白上展示外源蛋白或肽段，因此實現了基因型與表型的統(tǒng)一[63]。在噬菌體展示系統(tǒng)中最常用的噬菌體是M13[64]和T7[65]。自從1985年Smith首次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因pIII中建立該方法以來[66]，噬菌體展示技術已經發(fā)展成為鑒定和表征與特定分子（如抗體）結合的模擬肽的強大工具。使用噬菌體展示技術進行食物致敏原表位定位的第一步是選擇合適的噬菌體肽庫。食物致敏原研究中通常使用由長度為7～12 個氨基酸的肽組成的肽庫[67]。接著對噬菌體肽庫進行3～5 輪的生物淘選，篩選出與目標靶分子特異性結合的高度富集噬菌體。最后進行噬菌體測序得到序列信息，利用生物信息學技術分析獲得表位相關信息。噬菌體展示技術法識別模擬表位的速度很快，不需要復雜的晶體，但模擬表位的識別可能會脫靶，且需要復雜的計算機建模來分析數據，因此噬菌體展示技術與機器算法相結合是一種識別致敏原構象性表位的有效方法[68]。

Li Xin等利用噬菌體環(huán)七肽庫（Ph.D.-C7C）篩選β-乳球蛋白的模擬表位，通過Peptiope服務器的Mapitope算法計算相應的構象表位，首次鑒定出線性表位和構象性表位各自的共同氨基酸殘基[69]。接著從噬菌體肽庫（Ph.D.-12和Ph.D.-C7C）中獲得牛乳α-乳白蛋白上的線狀和構象的模擬表位，使用UniProt比對工具鑒定出6 個IgE和7 個IgG線性表位，用PyMOL檢測到5 個IgE和3 個IgG構象性表位[70]。此外，噬菌體展示技術在牛乳β-酪蛋白[71]、小龍蝦肌球蛋白輕鏈[72]、青蟹肌漿蛋白[73]、雞蛋卵轉鐵蛋白、桃子Pru p 3蛋白、花生Ara h 1蛋白等食物致敏原表位定位中的應用均有報道。

2.2.3 X射線晶體學

隨著生物物理技術的發(fā)展，X射線晶體學分析、質譜、核磁共振技術等在B細胞線性和構象性表位定位中發(fā)揮著重要作用。由于核磁共振技術使用時，通常需要用15N和13C標記原子核，且只能分析分子質量較小的靶抗原（＜30 kDa），因此其應用受到限制。在食物致敏原表位定位中，X射線晶體學分析和質譜的應用更廣泛[74]。

基于抗原-抗體復合物晶體結構的X射線晶體學分析是定位構象性表位的最理想、最精準的方法[75]。X射線晶體學分析涉及抗原和單抗的純化、抗原-單抗復合物的形成與純化以及復合物的晶體學解析等過程[76]。獲得抗原抗體復合物的結晶后，通過X射線晶體學或核磁共振波譜分析抗原-抗體復合物，可得到表位的結構，并確定與抗體殘基接觸的原子。Albillos等通過X-ray技術研究杏仁種子中致敏原Pru 1的致敏性，得到了純度高、結構清晰的蛋白結晶，有助于在分子水平上進一步表征植物種子中11S球蛋白致敏原的致敏性[77]。如果兩個原子間距離小于4 ?，則表示兩個殘基之間發(fā)生了接觸，由此可獲得構象性表位[72]。目前此法只針對抗原與單克隆抗體的研究，適用于細菌或病毒抗原，特別是可溶性小蛋白的研究。但此法在食物致敏原研究中的運用并不廣泛，原因是較難獲得高純度的食物致敏原-抗體結晶，而且難以從食物過敏患者血清中獲得大量特異性IgE抗體，有研究用致敏BALB/c小鼠雜交細胞產生的IgG代替患者血清IgE[78]。

2.2.4 質譜法

質譜法是近年來發(fā)展起來的表位定位技術，用于確定與溶液中抗體相互作用的可溶性抗原的表位。利用免疫親和技術分離出與抗體結合的抗原肽段后，用質譜技術鑒定含有抗原表位的肽段，最后與抗原天然序列對比獲得表位信息。最常用于獲取抗原肽段的方法是酶解法，有“表位切除”和“表位提取”兩種方法。前者是將抗原與抗體免疫共沉淀后用蛋白酶水解，抗原表位與抗體結合的部位會受到保護而不被酶解，后者是將抗原用蛋白酶消化后進行免疫共沉淀[79]?！氨砦磺谐焙汀氨砦惶崛　背绦蚓乖谌芤褐械乃膺^程以及從免疫復合物中除去未結合成分的各種洗滌步驟，且兩種方法均能有效地篩選酶解后的抗原表位部分[80]。氕/氘交換-質譜技術的出現提高了質譜表位作圖的精確度，但仍低于X射線晶體學技術的準確度。腰果致敏原7S球蛋白（Ana o 1）的表位通過氕/氘交換-質譜被揭示，在比較了重組Ana o 1和與mAb 2G4結合的Ana o 1 的氕/氘交換信息后，發(fā)現5 個線性表位優(yōu)勢區(qū)域，其中有兩個區(qū)域是構象性表位的組成部分[81]。利用生物信息學預測表位后，結合質譜結果對比分析也是一種可行的思路，已經在小麥致敏原CM16線性B細胞表位的定位中得到驗證[82]。

2.2.5 氨基酸定點突變和嵌合蛋白法

氨基酸定點突變和嵌合蛋白法都是研究IgE表位的常用方法，經常結合使用。氨基酸定點突變技術是指人工替換抗原序列上的某個氨基酸，然后比較突變型抗原和野生型抗原與抗體的識別情況，以此為依據鑒定表位[83]。叢艷君等利用合成肽法初步獲得牛乳致敏原α-乳白蛋白的表位，再用丙氨酸依次取代作用表位的氨基酸合成新的多肽，通過酶聯免疫吸附分析法識別出表位的關鍵氨基酸[84]。

重組蛋白是指利用基因重組技術將抗原蛋白的某一DNA區(qū)域插入載體蛋白的相關DNA區(qū)域，隨后在宿主細胞內表達的蛋白。利用免疫測定法測定表達的重組蛋白，以確定抗體結合區(qū)域。此法已經成功用于腰果致敏原Ana o 3抗原表位的解析，關鍵抗原表位串聯重組蛋白也為過敏患者血清特異性IgE的檢測提供了新的思路[85]。Alcocer等通過替換結構域上的蛋白構建了幾種嵌合蛋白，將巴西堅果致敏原Ber e 1的部分蛋白置換成結構相似但致敏性更低的向日葵種子蛋白。嵌合蛋白的圓二光譜顯示出其與天然對照物具有相似的α-螺旋二級結構，表明二級結構在蛋白質表達過程中沒有受到影響[86]。

2.2.6 細胞表位預測法

近年來，B細胞表位作圖技術和生物信息學的快速發(fā)展，極大地促進了免疫信息學的發(fā)展，學者們可以在免疫學中應用計算機來揭示抗體、B細胞和致敏原的結構，便于在分子層面進一步研究抗原-抗體復合物形成過程。通過各種網絡服務器對B細胞表位進行預測有助于更精確地定位B細胞表位。B細胞表位數據庫綜合了大量可供用戶搜索的數據，可分為IEDB、AntiJen等綜合型數據庫，BciPep、Epitome、SDAP、SEDB等B細胞專屬數據庫[87-88]。

B細胞線性表位預測主要基于二級結構和蛋白質理化性質，如局部親水性、表面可及性、可塑性、抗原性等[89]。早期多使用單參數方法進行預測，但局限性較大且效果較差。為了提高預測性能，常結合多種致敏原特征進行綜合分析，并提出了基于HMM、ANN和SVM等機器學習的方法，其中最常使用的是SVM[90]。目前常用的B細胞線性表位預測服務器有ABCPred[91]、BepiPred[92]、BCPred[93]、SVMTriP[94]、LBtope[95]、APCPred[96]等（表2）。

表2 預測B細胞線性表位的服務器Table 2 List of available web servers for continuous B-cell epitope prediction

B細胞構象性表位的預測相對于線性表位較困難，但隨著后基因組時代的到來、生物信息數據庫的擴大、免疫信息學和計算機科學技術的快速發(fā)展，對B細胞構象性表位的預測工具應運而生。目前的研究方法主要基于三維結構信息、抗原抗體結合時的特異性或模擬表位信息[97]。最早的結構和溶劑可及性的表位預測服務器為CEP，要求使用PDB格式的的三維數據[98]，后來產生了DiscoTope、ElliPro、SEPPA等基于三維結構的服務器。EpiPred通過抗體對抗原表位的特定傾向指數篩選表位殘基[99]。MIMOX、PEPITOPE、EPISEARCH等服務器基于模擬表位信息預測構象性表位。目前經常使用的預測服務器有EPCES[100]、DiscoTope[101]、PEPITO[102]、ElliPro[103]、SEPPA[104]、CBTOPE[105]、EPSVR[100]、MIMOX[106]、PEPITOPE[107]等，這些服務器要求的數據輸入格式不盡相同（表3）。

同源建模服務器SWISS-MODEL可對水牛β-乳球蛋白的三維結構進行建模，結合噬菌體篩選的陽性表位候選序列，經過MIMOX作圖可獲得水牛的構象性表位[108]。Mishra等共使用了10 個網絡工具，如ABCPred、BCPred、BepiPred、BcePred等，并結合多種方法鑒定了花生的7 種致敏原的B細胞表位，一共預測出26 個線性和18 個構象性表位，發(fā)現大部分預測的B細胞殘基均處于卷曲區(qū)域，預測出的6 個線性表位與大豆、榛子、番茄、玉米、蘋果、香蕉等致敏原具有相似性，表明花生致敏原可能與某些已知的食物致敏原具有交叉反應性[109]。B細胞網絡預測工具也已成功運用于預測日本沼蝦原肌球蛋白[110]、大豆主要過敏原Gly m Bd 28K[111]等食物致敏原B細胞線性或構象性表位。

表3 預測B細胞構象性表位的服務器Table 3 List of available web servers for discontinuous/conformational B-cell epitope prediction

3 結 語

致敏原表位定位是食物過敏研究的基礎和關鍵，為研究致敏原的結構與功能、致敏原與抗體反應機制提供理論基礎。致敏原表位數據的完善可推進食物過敏的發(fā)病和免疫耐受的機制研究，指導相關食物過敏的治療。其次，基于表位對食物致敏原進行檢測能使檢測操作更簡單、結果更靈敏，進一步為過敏患者提供更為準確的食物過敏標簽。同時表位數據可指導食品企業(yè)精準開發(fā)低致敏性產品，最大限度保證過敏患者的安全食用。

致敏原表位的定位已經通過T細胞增殖實驗、TGEM法、合成肽技術、噬菌體展示技術、X射線晶體學、氨基酸定點突變等策略和技術得以實現。在生物信息學表位預測方面也有驚人的進步。相信隨著各學科的不斷發(fā)展和科研人員的不斷努力，對食品蛋白結構和致敏原免疫反應活性的認識將逐步提高，對食物致敏原表位的研究一定會取得突破性的進展。