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    轉(zhuǎn)化生長因子-β受體在男性雄激素性脫發(fā)患者頭皮毛囊中的表達(dá)意義

    2021-05-19 07:53:08董佳輝萬苗堅
    實用皮膚病學(xué)雜志 2021年2期
    關(guān)鍵詞:區(qū)組毛根枕部

    董佳輝,萬苗堅,計 斌

    雄激素性脫發(fā)(androgenetic alopecia,AGA)是一種比較常見的脫發(fā)性疾病。目前已經(jīng)認(rèn)識到,AGA 是在遺傳背景上由雄激素觸發(fā)和介導(dǎo)的進(jìn)行性脫發(fā)性疾病,其發(fā)病的時間、進(jìn)程和嚴(yán)重程度又受其他因素的影響,如睡眠、情緒等[1]。AGA 發(fā)病的分子機制尚未完全闡明,且現(xiàn)有的治療方法效果不十分滿意。研究表明,AGA 的發(fā)病還可能與一系列信號通路異常有關(guān)。其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)/β2 可能是AGA 中雄激素與受體作用后的下游分子之一,抑制毛囊外毛根鞘細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)分化和凋亡,參與AGA 的發(fā)病[2]。而TGF-β 必須與細(xì)胞膜上高親和性TGF-β 受體(TGF-β receptor,TGF-βR)結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[3]。因此,為了明確AGA 發(fā)病機制,有必要了解AGA 患者毛囊中TGF-βR 表達(dá)情況。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 標(biāo)本來源 15 例男性AGA 為廣州粵秀整形機構(gòu)樂鬃毛發(fā)移植中心接受毛發(fā)移植的患者,Hamilton分型為Ⅳ~Ⅴa 型,年齡23 ~46 歲,平均(34.6±7.8)歲,近3 個月未系統(tǒng)使用抗雄激素藥物和局部使用任何育發(fā)類產(chǎn)品或藥物治療,頭皮正常完整,無細(xì)菌、真菌等感染性疾病及皮炎濕疹等炎癥性皮膚病。對實驗內(nèi)容知曉并簽署知情同意書。健康志愿者5 例均為男性,作為對照組,年齡(33.0±6.2)歲,為頭皮外科手術(shù)患者,無AGA 現(xiàn)癥及家族史,毛發(fā)生長正常。

    1.1.2 取材部位選擇及方法 AGA 患者頭皮分枕部非脫發(fā)區(qū)、脫發(fā)過渡區(qū)、脫發(fā)區(qū)三個區(qū)域,每個區(qū)域用同一鉆孔刀(slot pouch ?3 mm,Micro-Tools Europe,Germany)各取3 塊頭皮組織,每塊體積3 mm×3 mm×5 mm。對照組取原手術(shù)區(qū)在額頂部位的含毛囊頭皮組織,分成每塊體積3 mm×3 mm×5 mm。

    1.1.3 實驗分組 實驗分組為①對照組、②AGA 枕部非脫發(fā)區(qū)組、③AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組、④AGA 脫發(fā)區(qū)組。

    1.1.4 主要試劑及儀器 兔抗人TGF-βRⅠ多克隆抗體(Abcam 公司);小鼠抗人TGFRⅡ單克隆抗體(Santa Cruz 公司);SP 二抗(上海長島公司);Olympus 81i光學(xué)顯微鏡等。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)本制作 新鮮組織取材后立即用10%甲醛固定。將固定的標(biāo)本組織分離成只含1 ~2 根毛發(fā)的小組織,再進(jìn)行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋,包埋時盡量使毛囊縱軸與蠟塊面平行,切片時盡量以毛囊縱軸為方向,以3 μm 厚度進(jìn)行連續(xù)切片。

    1.2.2 免疫組化染色 每個毛囊的切片分別進(jìn)行TGFβRⅠ和TGF-RⅡ免疫組化染色。石蠟切片經(jīng)二甲苯10 min,共2 次;100%,95%,85%,80%乙醇各5 min,1 次;蒸餾水沖洗5 min,共3 次;3% H2O2室溫下10 min,1 次;蒸餾水沖洗5 min,1 次;0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復(fù),自然冷卻至室溫后,PBS沖洗5 min,共3 次;10%正常山羊血清室溫封閉10 min,傾去,勿洗;分別滴加TGF-βRⅠ多克隆抗體(1:50稀釋,用PBS 稀釋)和TGF-βRⅡ單克隆抗體(1:50稀釋,用PBS 稀釋),以PBS 代替一抗做陰性對照,放入濕盒內(nèi)4℃過夜(>14 h);室溫復(fù)溫30 min,PBS 沖洗5 min,共3 次;滴加生物素標(biāo)記二抗,37℃孵育30 min;PBS 沖洗5 min,共3 次;滴加顯色底物DAB,鏡下觀察,適時終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染15 ~30 s,流水沖洗5 ~10 min;常規(guī)脫水、透明、封片。

    1.2.3 結(jié)果判定和記錄 均以生長期毛囊為觀察對象。TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ免疫組化陽性著色表現(xiàn)為胞膜和胞質(zhì)染成褐色。光學(xué)顯微鏡下觀察見細(xì)胞中出現(xiàn)淺黃至棕褐色顆粒視為陽性細(xì)胞,凡細(xì)胞顯色強度與背景無明顯差別者則為陰性細(xì)胞。每組至少觀察30 個毛囊,分別記錄毛囊中TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ染色強度(陰性為-,淺褐色為+,黃褐色為2+,棕褐色為3+)、分布和陽性毛囊數(shù)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0。采用多組有序多分類資料的秩和檢驗和χ2檢驗。設(shè)定雙側(cè)P<0.05 為統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。

    2 結(jié)果

    2.1 TGF-βRⅠ在毛囊中的表達(dá)

    正常對照組和AGA 患者各組標(biāo)本生長期毛囊均有TGF-βRⅠ的表達(dá),表達(dá)于整個外毛根鞘,以淺褐色~黃褐色為主,毛囊內(nèi)毛根鞘和真皮乳頭均未見明顯表達(dá)(圖1,圖2)。各組毛囊TGF-βRⅠ的表達(dá)見表1。各組毛囊中TGF-βRⅠ表達(dá)無顯著性差異(H=0.648,P>0.05)。

    2.2 TGF-βRⅡ在毛囊中的表達(dá)

    圖1 各組毛囊中TGF-βRⅠ的表達(dá)(SP法染色×200)

    圖2 各組毛囊真皮乳頭TGF-βRⅠ的表達(dá)(SP法染色×200)

    表1 各組毛囊中TGF-βRⅠ的表達(dá) (個)

    表2 各組毛囊中TGF-βRⅡ的表達(dá) (個)

    在正常對照組和AGA 枕部非脫發(fā)區(qū)組毛囊中均未見TGF-βRⅡ表達(dá);AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組有34.4%(11/32)的毛囊其外毛根鞘可見有輕度TGF-βRⅡ表達(dá),以淺褐色為主;AGA 脫發(fā)區(qū)組有51.6%(16/31)的毛囊其外毛根鞘可見有輕度TGF-βRⅡ表達(dá),以淺褐色為主;各組毛囊的內(nèi)毛根鞘和真皮乳頭均未見TGF-βRⅡ表達(dá)(圖3,4)。TGF-βRⅡ在各組毛囊中的表達(dá)情況見表2。

    合并表2 中+和2+數(shù)據(jù),然后進(jìn)行二分類資料比較的χ2檢驗,比較各組毛囊中TGF-βRⅡ表達(dá)陽性毛囊率。正常對照組和AGA 枕部非脫發(fā)區(qū)組與AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組及脫發(fā)區(qū)組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P過渡區(qū)=2.538×10-4<0.05;P脫發(fā)區(qū)=1.482×10-6<0.05),AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組和脫發(fā)區(qū)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.911,P>0.05)。

    圖3 各組毛囊中TGF-βRⅡ的表達(dá)(SP法染色×200)

    圖4 各組毛囊真皮乳頭TGF-βRⅡ的表達(dá)(SP 法染色×200)

    3 討論

    AGA 患者受累毛囊表現(xiàn)為毛囊由生長期提前進(jìn)入退行期,毛囊生長期逐漸地進(jìn)行性縮短,毛囊再生不完全,逐漸微型化,毛發(fā)則逐漸變短、變細(xì),毫毛化,至最終形成禿發(fā)[4]。因此,明確誘導(dǎo)毛囊進(jìn)入退行期和抑制毛囊再生的分子機制對了解和防治AGA 至關(guān)重要。實驗證實,多種細(xì)胞因子參與了毛囊退行期的調(diào)控,如Fas,TGF-β,腫瘤壞死因子(TNF)-α,成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-5,胰島素樣生長因子(IGF)-1,神經(jīng)營養(yǎng)素等[5,6]。TGF-β 是參與人類毛囊退行期調(diào)控的重要因子之一,在人類毛囊周期循環(huán)中起著重要的作用,調(diào)控著毛囊細(xì)胞的增殖、分化和凋亡,從而維持和改變著毛囊的形態(tài)[7]。

    研究發(fā)現(xiàn),雄激素可刺激AGA 患者脫發(fā)區(qū)毛囊真皮乳頭細(xì)胞分泌更多TGF-β1/β2,并使其活性增加,它們均是毛囊退行期強誘導(dǎo)劑,抑制毛囊外毛根鞘角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其分化和凋亡,使毛囊生長期縮短,毛囊提前出現(xiàn)退行期改變[2,8,9]。TGF-β 被認(rèn)為可能是雄激素在AGA 發(fā)病中的下游分子機制之一。TGF-β必須與細(xì)胞膜表面的TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ一起結(jié)合才能發(fā)揮其作用,這兩種受體是信號傳導(dǎo)所必需的,且是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的首要環(huán)節(jié),只與一種受體結(jié)合是無效的[3]。目前關(guān)于AGA 患者毛囊中TGF-βRⅠ和RⅡ的表達(dá)情況,鮮見文獻(xiàn)報道。所以對AGA 患者毛囊TGF-βR 表達(dá)的研究是非常必要的,可進(jìn)一步從TGF-βR 角度探討TGF-β 信號通路的在AGA 發(fā)病中的可能作用。

    本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),TGF-βRⅠ表達(dá)于各組毛囊整個外毛根鞘,而內(nèi)毛根鞘和真皮乳頭未見表達(dá),各組間TGF-βRⅠ表達(dá)是無差異的。這與文獻(xiàn)報道的正常人生長期毛囊中TGF-βRⅠ表達(dá)的結(jié)果一致[10]。提示,TGF-βRⅠ在AGA 毛囊中的表達(dá)沒有異常,TGFβRⅠ的表達(dá)不是AGA 發(fā)病的因素,在AGA 發(fā)病中可能處于從屬的地位。在正常對照組和AGA 枕部非脫發(fā)區(qū)組毛囊均未見有TGF-βRⅡ的表達(dá);AGA 脫發(fā)過渡區(qū)組毛囊中,有34.4%(11/32)的毛囊其外毛根鞘可見有TGF-βRⅡ表達(dá);AGA 脫發(fā)區(qū)組毛囊中,有51.6%(16/31)的毛囊其外毛根鞘可見有TGF-βRⅡ表達(dá);各組毛囊的內(nèi)毛根鞘和真皮乳頭均未見有TGF-βRⅡ表達(dá)。結(jié)果表明,在男性AGA 患者脫發(fā)區(qū)和脫發(fā)過渡區(qū)有毛囊同時表達(dá)TGF-βRⅠ和RⅡ。因此,從TGF-βR 角度來看,提示這些毛囊中可能存在TGF-β 信號通路活化的跡象。結(jié)合既往研究,雄激素可刺激AGA 患者脫發(fā)區(qū)毛囊真皮乳頭細(xì)胞分泌更多TGF-β1/β2,并使其活性增加[2,8,9],進(jìn)一步提示AGA患者受累毛囊存在TGF-β 信號通路活化的跡象。

    至于AGA 患者脫發(fā)區(qū)和脫發(fā)過渡區(qū)生長期毛囊出現(xiàn)TGF-βRⅡ的異常表達(dá)的原因,還不清楚。AGA是在遺傳背景上發(fā)生的脫發(fā)性疾病,脫發(fā)的部位主要發(fā)生在前額—頂部,而兩鬢和枕部不受影響,脫發(fā)部位的特殊性與脫發(fā)區(qū)毛囊和頭皮的雄激素受體、Ⅱ型5-α 還原酶和二氫睪酮(DHT)水平特異性升高有關(guān)[11]。AGA 毛囊TGF-βRⅡ異常表達(dá)與AGA 脫發(fā)部位的特殊性存在一定的一致性,也與AGA 患者頭皮毛囊雄激素受體、Ⅱ型5-α 還原酶和DHT 部位特異性增高一致。因此,推測AGA 脫發(fā)區(qū)和脫發(fā)過渡區(qū)毛囊TGF-βRⅡ異常表達(dá)可能與遺傳有一定的關(guān)系。TGF-βRⅡ在男性AGA 患者脫發(fā)區(qū)和脫發(fā)過渡區(qū)生長期毛囊存在異常表達(dá),參與了這些部位毛囊的病變過程,而在枕部非脫發(fā)區(qū)毛囊未見有TGF-βRⅡ,說明該部位生長期毛囊不存在TGF-β 信號通路活化,同時該部位毛囊中雄激素受體、Ⅱ型5-α 還原酶和DHT 水平也低,雄激素也不能刺激該部位毛囊真皮乳頭細(xì)胞產(chǎn)生過多的抑制性細(xì)胞因子TGF-β1/β2,這就進(jìn)一步解釋了為何毛囊從枕部移植到前額-頂部脫發(fā)區(qū)能成活且不再發(fā)生AGA 樣的毛囊組織病理改變的原因。

    各組毛囊真皮乳頭細(xì)胞均未表達(dá)TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ,提示該部位可能不受TGF-β 信號通路的影響,這可能是AGA 受累毛囊真皮乳頭長期保留[12]的機制之一。

    綜上,男性AGA 患者脫發(fā)過渡區(qū)和脫發(fā)區(qū)的部分生長期毛囊存在TGF-β 信號通路活化的跡象,其中TGF-βRⅠ表達(dá)可能不是男性AGA 發(fā)病主要的因素;TGF-βRⅡ的異常表達(dá)可能在男性AGA 發(fā)病中起重要的作用。它與TGF-βRⅠ一起活化TGF-β 信號通路,使生長期毛囊中細(xì)胞增殖活性下降,毛囊生長受到抑制,毛囊漸微型化至最終形成脫發(fā)。這為今后從TGF-βR 封閉的角度開發(fā)新的治療AGA 手段提供了重要的理論依據(jù)。特別是TGF-βRⅡ,或從TGF-β1/β2 拮抗劑角度兩個方面,來阻斷TGF-β 信號通路在AGA 中的異?;罨?,從而為治療AGA 開辟新的途徑。

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