Alagille綜合征臨床病理及基因突變特征分析1例*

李 紅， 周儷姍， 王 芳， 湯建橋， 鄢素琪

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430016

Alagille綜合征(Alagille syndrome，ALGS)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，其病變可累及肝臟、心臟、骨骼、眼睛、顏面及腎臟等多器官，最早在1969年由Alagille及其同事報(bào)道，并在1975年由Alagille[1]再次報(bào)道并確定了診斷標(biāo)準(zhǔn)。近年來分子遺傳學(xué)研究證實(shí)，ALGS與Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路中JAG1基因和NOTCH2基因突變有關(guān)，其中94%～96%患者存在JAG1基因(20p12)突變，2%～3%患者與NOTCH2基因(1p12)突變有關(guān)[2]。其中符合經(jīng)典臨床特征，由編碼Jagged1的JAGl基因(OMIM：601920)突變或缺失所引起的，稱之為ALGS1型；與經(jīng)典臨床特征不完全符合，腎臟病變及膽管稀疏多見，骨骼畸形及特征性面容相對(duì)少見，由NOTCH2基因(OMIM：600275)突變導(dǎo)致的，稱之為ALGS2型[3]。國外該病的發(fā)病率約為1/30000[2]，但我國目前尚無相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。該病臨床表現(xiàn)變異性高，發(fā)病率低，臨床確診難度大，近年來分子診斷技術(shù)的開展提高了本病的確診率。本文報(bào)道1例JAG1基因突變ALGS患兒的臨床病理特征及分子診斷結(jié)果，為本病診斷提供參考。

1 臨床資料

患兒，男，2月12 d。因“發(fā)現(xiàn)皮膚鞏膜黃染2月余”入院?；純簽榈?胎第1產(chǎn)，出生體重2.65 kg，足月自然產(chǎn)，否認(rèn)窒息搶救史?；純撼錾鷷r(shí)全身皮膚及鞏膜黃染，并逐漸加重，大便淺黃色，7～8次/d，偶有陶土色大便，小便色黃，母乳喂養(yǎng)，否認(rèn)嗆奶，無發(fā)熱，無咳嗽，無抽搐。曾于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院予護(hù)肝利膽治療，患兒無明顯好轉(zhuǎn)。經(jīng)會(huì)診后在外科全麻下行腹腔鏡下膽道造影術(shù)。術(shù)中可見肝內(nèi)外膽管顯影，術(shù)中診斷“膽汁淤積性肝炎”，予膽道沖洗，術(shù)后行抗感染(頭孢他啶)、抗病毒(更昔洛韋)、護(hù)肝(阿拓莫蘭、肌苷、門冬氨酸鳥氨酸、思美泰)、利膽(熊去氧膽酸及中藥復(fù)方煎劑口服)對(duì)癥治療20 d，患兒黃疸稍有消退出院。1周后患兒因黃疸加重入住我院。查體：體重4.1 kg(<-2SD)，身長55 cm(<-2SD)。神志清楚，寬額頭，小下頜(圖1)，皮膚、鞏膜重度黃染。心律齊，心音有力，各瓣膜區(qū)未聞及雜音。雙肺呼吸音粗，未聞及干濕啰音及胸膜摩擦音。肝臟肋下2.5 cm，質(zhì)中，脾臟肋下1.0 cm，質(zhì)軟。雙下肢無水腫。輔助檢查，血檢常規(guī)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)9.46×109/L，血紅蛋白(HGB)100 g/L，血小板(PLT)462×109/L，淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)71.7%，中性粒細(xì)胞百分比(NEU%)18.9%，細(xì)胞形態(tài)未見異常。大便常規(guī)：正常。尿液分析：尿膽紅素(BIL)3+。血巨細(xì)胞病毒(CMV)抗體：CMV-IgM陽性，CMV-IgG陽性。血、尿CMV-DNA均陰性。EB病毒抗體：EB-IgG陽性，EBNA-IgG陽性。細(xì)小病毒B19、乙肝、丙肝、梅毒、HIV病毒抗體均為陰性。甲狀腺素(T4)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、促甲狀腺激素(TSH)均正常。血銅藍(lán)蛋白測定正常。降鈣素原(PCT)0.190 ng/mL，超敏C反應(yīng)蛋白(CRP)正常。免疫全套：IgG 4.41 g/L。多次肝功能及膽汁酸等指標(biāo)顯著異常(表1)。腎功能、心肌酶譜、電解質(zhì)、血糖、血氨均正常。乳酸(LAC)4.30 mmol/L。血脂：總膽固醇(CHOL)6.50 mmol/L，甘油三酯(TG)2.34 mmol/L，高密度脂蛋白(HDL)0.13 mmol/L，低密度脂蛋白(LDL)3.39 mmol/L。凝血象：纖維蛋白原(FIB)1.96 g/L。血、尿串聯(lián)質(zhì)譜未見明顯異常。心電圖：不完全性右束支傳導(dǎo)阻滯。心臟彩超未見明顯異常。肝脾膽囊彩超：肝臟及脾臟未見明顯異常，膽囊充盈欠佳。胸部X線片(圖2)示T7椎骨呈蝶形畸形。上腹部磁共振(MR)平掃+磁共振膽胰管造影(MRCP)檢查未見膽囊顯示。SPECT肝膽動(dòng)態(tài)顯像示肝臟攝取功能差，清除功能減低，膽道系統(tǒng)排泄明顯受阻。肝組織活檢(圖3)符合膽汁淤積性肝臟病變表現(xiàn)。經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患兒家長知情同意，分別取患兒及其父母外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen公司，德國)從全血中提取DNA，通過Qubit及瓊脂糖凝膠電泳測定提取的DNA樣本含量及質(zhì)量。應(yīng)用Roche SeqCap EZ MedExome Kit以全外顯子組測序方法進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲，使用illumina Hiseq X-ten二代測序儀對(duì)富集的文庫進(jìn)行PE150測序，平均測序深度為100X，95%以上的區(qū)域達(dá)到20X以上的覆蓋度。測序后得到FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)，再經(jīng)過以下處理：①通過BWA軟件(v0.7.12-r1039)將短reads和參考基因組(hg19)進(jìn)行對(duì)比，確定短序列在基因組上的位置；②使用SAMtools軟件(v0.1.18)對(duì)這些短序列進(jìn)行排序，并進(jìn)行數(shù)據(jù)格式的轉(zhuǎn)換；③使用Picard軟件(v1.134)去除測序過程中產(chǎn)生的冗余信息和噪聲；④使用GenomeAnalysisTK(GATK v3.7)軟件尋找樣本測序數(shù)據(jù)與參考基因組差異的位點(diǎn)(包括SNV和InDel)；⑤使用ANNOVAR軟件(2016 Jul16 version)對(duì)這些變異位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋，并使用ExAC、1000 Genomes Project和ESP6500等普通人公共數(shù)據(jù)庫過濾突變。測序峰圖用Chromas2軟件觀察。根據(jù)二代測序檢測結(jié)果對(duì)患兒及其父母進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證排除假陽性。以上測序由杭州奕真生物科技公司完成，測序引物，正向：5′-CGCCTAGTTTCAAGCCAAAG-3′，反向5′- GA-GGGAGTCGCCACCTCTAT-3′，退火溫度60℃，產(chǎn)物長度491 bp。全外顯子組測序(圖4)檢出1個(gè)與表型相關(guān)的雜合型JAG1c.184G>T(p.G62X)無義突變，該變異為終止變異，導(dǎo)致第62位氨基酸之后編碼提前終止。家系驗(yàn)證結(jié)果顯示該雜合突變遺傳自父親。變異JAG1c.184G>T(p.G62X)導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)翻譯提前終止，理論上嚴(yán)重危害蛋白質(zhì)功能，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南進(jìn)行致病性評(píng)級(jí)，該變異致病性評(píng)級(jí)符合PVS1 +PM2，為疑似致病性變異。

患兒臨床表現(xiàn)為黃疸，特殊面容(圖1)，蝶形椎骨(圖2)，實(shí)驗(yàn)室檢查提示ALT、AST、ALP、γ-GT、TBA等均明顯異常(表1)，CHOL、TG升高。肝組織活檢符合膽汁淤積性肝臟表現(xiàn)(圖3)。全外顯子組測序(圖4)提示JAG1c.184G>T(p.G62X)無義突變?；純涸\斷ALGS。

圖1 Alagille綜合征患兒特殊面容Fig.1 Typical facial features of this case

箭頭所示T7椎骨呈蝶形畸形

鏡下見肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，肝細(xì)胞變性，肝細(xì)胞及膽小管內(nèi)膽汁淤積，匯管區(qū)纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤。

A、B、C分別表示患兒、其母親、其父親的測序峰圖；箭頭所示為雜合套峰

表1 隨年齡變化動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)Table 1 Changes of laboratory indexes with age

2 討論

2.1 臨床特征分析

①ALGS確診費(fèi)時(shí)長?；純阂颉包S疸”這一突出臨床表現(xiàn)多次就診，并因此反復(fù)住院3次，經(jīng)歷有創(chuàng)的腹腔鏡膽道造影檢查，最終經(jīng)全外顯子組測序檢查明確診斷。由此可見臨床上要將ALGS與其它病因?qū)е碌哪懼俜e性肝病相鑒別，存在相當(dāng)程度的困難。②ALGS面部特征直觀，診斷價(jià)值較高。慢性淤膽、特征性面容、心血管異常、蝶形椎骨、角膜后胚胎環(huán)是ALGS的5大典型臨床特征，其病變雖然涉及多個(gè)系統(tǒng)，但有些患者脊柱、眼睛、腎臟異常的臨床表現(xiàn)并不顯著。本例患兒有臉小額寬且前額突出、眼窩深陷眼距寬、下頜尖向前突出的典型“倒三角型”面容(圖1)，面部特征直觀，提示臨床體檢時(shí)應(yīng)引起高度關(guān)注。③ ALGS表型變異性高，個(gè)體表現(xiàn)度差別大。雖有文獻(xiàn)報(bào)道[4]ALGS的顯性率達(dá)98%左右，但由于各種復(fù)雜因素的影響，常染色體顯性遺傳的雜合子可能表現(xiàn)為不規(guī)則顯性或者不完全顯性，也可表現(xiàn)為不同的表現(xiàn)度和不外顯[5]，導(dǎo)致不同個(gè)體間臨床表現(xiàn)差異很大。多項(xiàng)研究報(bào)道，即使同一家庭攜帶同一種變異的不同個(gè)體之間，其表現(xiàn)也可能各異，輕者癥狀輕微甚至無癥狀，重者則具有典型的臨床表現(xiàn)及嚴(yán)重的并發(fā)癥，需要肝移植[6]。甚至在遺傳背景完全相同的個(gè)體之間，其臨床表現(xiàn)也可能不一致。據(jù)報(bào)道，一對(duì)均因JAG1突變致病的同卵雙生雙胞胎，其中一個(gè)出現(xiàn)嚴(yán)重的肺動(dòng)脈閉鎖和輕微肝損傷，另一個(gè)則出現(xiàn)嚴(yán)重的肝臟病變而需肝臟移植[7]。④ALGS具有不外顯現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，2例ALGS患兒的變異均來自于母親，但其母親無任何相應(yīng)臨床表現(xiàn)[8]。本例患兒的變異來自于父親，其父親也無相關(guān)臨床表現(xiàn)。ALGS患者臨床表現(xiàn)與其基因突變的相關(guān)性目前還不清楚，推測可能一些遺傳修飾基因發(fā)揮了作用[9]。

2.2 ALGS病理診斷及拓展

ALGS經(jīng)典診斷標(biāo)準(zhǔn)為肝組織活檢病理證實(shí)存在肝內(nèi)小葉間膽管數(shù)量減少或缺如，并具備3個(gè)主要臨床表現(xiàn)。但隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)部分ALGS患者其小葉間膽管的異常是在生后逐漸發(fā)生的，在嬰兒早期并無小葉間膽管減少或消失，在出生后的前3個(gè)月ALGS肝內(nèi)膽管稀疏癥的病理改變并不顯著[10]，甚至有病例因以肝內(nèi)膽管增生擴(kuò)張為主要病理表現(xiàn)而被誤診為膽道閉鎖[11]。該發(fā)現(xiàn)動(dòng)搖了“ALGS患者肝組織活檢存在小葉間膽管減少或缺乏”這個(gè)一度被認(rèn)為是最重要且恒定特征的觀點(diǎn)。還有研究報(bào)道6月齡前行肝組織活檢，病理發(fā)現(xiàn)有小葉間膽管缺乏的約占60%；而6月齡后進(jìn)行肝組織活檢，這一比例可上升至95%[12]。對(duì)于3歲以下的ALGS患者，有研究認(rèn)為其肝組織活檢病理常以肝巨大細(xì)胞、膽管異常增生、肝內(nèi)膽汁淤積為主[13]，而非特征性的肝內(nèi)膽管稀少。本例肝組織活檢也以肝臟膽汁淤積的病理表現(xiàn)為主，未發(fā)現(xiàn)典型的小葉間膽管減少缺乏(圖3)。此外，還有研究報(bào)道[14]，ALGS可能不是唯一具有小葉間膽管缺乏的綜合征(尤其是小于胎齡的新生兒)，HNF1β缺陷也應(yīng)考慮排除。因此結(jié)合患兒年齡段，選擇合適時(shí)機(jī)完善肝組織活檢，并動(dòng)態(tài)追蹤，綜合分析肝組織活檢結(jié)果，可以一定程度上避免漏診誤診ALGS。

2.3 基因突變分析

隨著對(duì)ALGS認(rèn)識(shí)的不斷積累，近年對(duì)ALGS的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂[15]，其內(nèi)容為：如果肝組織活檢不表現(xiàn)為肝內(nèi)小葉間膽管數(shù)量減少或缺如，或未行肝組織活檢者，符合4個(gè)或以上主要表現(xiàn)也可診斷；如果已知有JAG1基因突變或家族陽性史時(shí)，具備1個(gè)或以上主要表現(xiàn)也可確診ALGS。該標(biāo)準(zhǔn)使ALGS的診斷從臨床診斷、病理診斷階段過渡到結(jié)合分子診斷的階段。JAGl基因定位于染色體20p12，共有26個(gè)外顯子，全長36 kb。JAGl蛋白含1218個(gè)氨基酸，由胞內(nèi)段、跨膜段及膜外區(qū)域組成，作為配體參與Notch信號(hào)通路[16]。自首次被分子診斷以來，目前已發(fā)現(xiàn)500多種JAG1基因突變，包括錯(cuò)義突變、無義突變、插入、缺失、剪接位點(diǎn)突變等多種突變類型。國內(nèi)的一項(xiàng)研究報(bào)道在76.9%患者中檢測到JAG1致病突變[17]。本例患兒JAG1基因2號(hào)外顯子存在雜合突變c.184G>T(p.G62X)，使184位核苷酸鳥嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取代，為終止變異，導(dǎo)致第62位甘氨酸之后編碼的蛋白質(zhì)翻譯提前終止，可能對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能產(chǎn)生影響。查閱外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(ExAC，http：//exac.broadinstitute.org)、千人基因組計(jì)劃(http：//browser.1000 genomes.org)、基因組聚合數(shù)據(jù)庫(gnomAD，http：//gnomad-old.broadinstitute.org)，目前均未收錄該變異信息。ClinVar數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD，http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中目前也均未有該變異的報(bào)道。目前ALGS以支持治療為主，無根治手段。肝移植的適應(yīng)證包括嚴(yán)重的瘙癢、合成功能障礙、門靜脈高壓、反復(fù)骨折和嚴(yán)重生長發(fā)育遲緩[2]。隨訪得知，本例患兒后行2次肝移植，現(xiàn)黃疸消退，病情穩(wěn)定，其遠(yuǎn)期預(yù)后有待進(jìn)一步觀察。

ALGS的低發(fā)病率及寬泛的臨床表現(xiàn)，肝組織活檢病理變化的時(shí)限性，使得臨床醫(yī)生在診斷該病時(shí)面臨巨大挑戰(zhàn)，早期對(duì)膽汁淤積性肝病患兒開展Notch信號(hào)通路JAG1致病基因篩查，有助于ALGS的診斷。