促紅細(xì)胞生成素衍生肽對動脈粥樣硬化心肌缺血大鼠新生血管密度及VEGF/VEGFR通路的影響

薛娟，馬曉

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦切难芗膊≈谐Ｒ姷囊环N疾病，研究顯示，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，嚴(yán)重威脅人們的生命健康[1]，其主要病理特征是動脈粥樣硬化斑塊破裂伴隨血栓形成和心肌缺血[2]。因此，消除或控制動脈粥樣硬化的危險因素，對于預(yù)防冠心病至關(guān)重要。動脈粥樣硬化主要特征是中動脈和大動脈血管壁膽固醇的局部蓄積形成斑塊和機(jī)體炎癥反應(yīng)[3]。新血管形成在斑塊生長和不穩(wěn)定中起主要作用。研究顯示，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與其受體VEGFR2結(jié)合在血管內(nèi)皮細(xì)胞中參與血管生成過程[4,5]。研究報道，抑制VEGFs/VEGFRs信號通路可減少血管新生，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊[6]。促紅細(xì)胞生成素衍生肽（HBSP）是促紅細(xì)胞生成素衍生的一種螺旋B表面活性肽，有促紅細(xì)胞生成素抗炎、抗氧化等作用，但無高血壓、紅細(xì)胞增多癥、血栓形成等不良反應(yīng)[7]，在治療急性心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷疾病中發(fā)揮重要作用[8,9]，HBSP在冠心病中對新生血管影響的研究報道較少，本研究通過觀察HBSP對動脈粥樣硬化心肌缺血大鼠模型的作用，初步探討其治療冠心病的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF清潔級SD雄性大鼠，8周齡，體重約250 g，由北京生命科學(xué)研究所動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號為SYXK（京）2015-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑及儀器 HBSP由上?？齐纳镉邢薰咎峁兌?8.12%）；鹽酸異丙腎上腺素（北京索萊寶科技有限公司 貨號：SI9030）；C反應(yīng)蛋白（CRP）ELISA試劑盒（上海一研生物科技有限公司 貨號：EY-elisa-0694）；白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒（貨號：ml102828）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（貨號：ml059784）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒（Trizol法）（北京艾德萊生物科技公司 貨號：RN0401）；兔源多克隆VEGF抗體（貨號：PA5-16754）、兔源單克隆VEGFR2抗體（中國賽默飛世爾科技有限公司 貨號：MA5-15157）；兔源單克隆抗β-actin抗體（美國CST公司 貨號：3700S）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國R&D/Prosci/NovusBiologicals公司 貨號：YB-19442）；顯微鏡（上海炳宇光學(xué)儀器有限公司 型號：XDS-10）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司 型號：ChemiDocXRS）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠模型構(gòu)建及分組 將40只SD大鼠隨機(jī)分6組：對照組、模型組、陽性對照組、HBSP低、高劑量組，每組各10只，除對照組外，其余組大鼠構(gòu)建動脈粥樣硬化心肌缺血大鼠模型，參考相關(guān)文獻(xiàn)大鼠分別在第0、2、4周腹腔注射D3（60 U/kg），同時飼養(yǎng)高脂飼料4周，第5周灌胃高脂乳劑（10 ml/kg），連續(xù)4周。于造模的第1 d給藥，HBSP低、中、高劑量組：腹腔注射25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg HBSP，陽性對照組：灌胃辛伐他丁2 mg/kg，對照組和模型組：腹腔注射等量生理鹽水，給藥24 h后，8周后背部皮下注射鹽酸異丙腎上腺素（100 mg/kg·d），對照組皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)注射2 d。大鼠心電圖ST段升高則造模成功，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 標(biāo)本采集 給藥24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取腹腔主動脈血10 ml于離心管中，離心取上清（即血清）-80℃冰箱中待測；處死大鼠，分離主動脈組織，剪取約0.5 g用于提取組織蛋白，-80℃冰箱中備用，剩余組織用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片備用。用全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。用ELISA試劑盒分別檢測炎性因子CRP、IL-6、TNF-α含量，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。主動脈組織切片脫蠟至水化，CD31染色觀察大鼠新生血管形態(tài)變化，組織中細(xì)胞陽性呈黃色或棕褐色，通過Image J軟件檢測陽性細(xì)胞平均光密度值（MOD），反映新生血管密度。

1.3.3 Western blot法檢測各組大鼠主動脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白水平 提取主動脈組織蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，調(diào)整上樣蛋白至50 μg，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，加一抗（VEGF、VEGFR2、β-actin抗體，1:1000），4℃孵育過夜，次日加二抗（1:5000）室溫孵育2 h，洗膜，加ECL發(fā)光液，用Bio-Rad成像系統(tǒng)采集圖像，以β-actin為內(nèi)參照，Image J軟件定量分析蛋白灰度信號，計算蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBSP對各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）；與陽性對照組相比，HBSP低、中劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與HBSP低、中劑量組相比，HBSP高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05），表1。

2.2 HBSP對各組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著降低（P＜0.05）；與陽性對照組相比，HBSP低、中、高劑量組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）；與HBSP低、中劑量組相比，HBSP高劑量組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著降低（P＜0.05），表2。

2.3 HBSP對各組大鼠新生血管密度的影響 與對照組相比，模型組大鼠主動脈組織中CD31 MOD表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組鼠主動脈組織中CD31 MOD表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與陽性對照組相比，HBSP低、中劑量組鼠主動脈組織中CD31 MOD表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與HBSP低、中劑量組相比，HBSP高劑量組鼠主動脈組織中CD31 MOD表達(dá)顯著降低（P＜0.05），（圖1、表3）。

2.4 HBSP對各組大鼠主動脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組大鼠主動脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HBSP低、高劑量組鼠主動脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與陽性對照組相比，HBSP低、高劑量組鼠主動脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與HBSP低、中劑量組相比，HBSP高劑量組鼠主動脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），（圖2、表4）。

表1 HBSP對各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C表達(dá)的影響（±s，mmol/L）

表1 HBSP對各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C表達(dá)的影響（±s，mmol/L）

注：TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與陽性對照組相比，c P＜0.05；與HBSP低劑量組相比，d P＜0.05；與HBSP中劑量組相比，e P＜0.05

組別 n TC TG LDL-C HDL-C對照組 10 1.42±0.05 0.64±0.04 0.20±0.02 0.39±0.03模型組 10 1.87±0.06a 1.08±0.03a 0.37±0.01a 0.23±0.02a陽性對照組 10 1.62±0.05ab 0.70±0.02ab 0.23±0.01ab 0.33±0.03ab HBSP低劑量組 10 1.75±0.07abc 0.83±0.06abc 0.34±0.03abc 0.27±0.02abc HBSP中劑量組 10 1.73±0.05abc 0.80±0.04abc 0.32±0.02abc 0.29±0.03abc HBSP高劑量組 10 1.63±0.04abde 0.72±0.05abde 0.24±0.03abde 0.34±0.02abde F值 - 79.500 137.151 101.714 49.487 P值 - 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 HBSP對各組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響（±s）

表2 HBSP對各組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響（±s）

注：CRP：C反應(yīng)蛋白；IL-6：白介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子α；與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與陽性對照組相比，c P＜0.05；與HBSP低劑量組相比，d P＜0.05；與HBSP中劑量組相比，e P＜0.05

組別 n CRP（ng/ml） IL-6（pg/ml） TNF-α（pg/ml）對照組 10 3024.56±107.32 203.17±8.34 300.27±6.01模型組 10 3601.28±123.24a 241.32±5.17a 357.21±9.21a陽性對照組 10 3196.14±121.75ab 215.43±9.24ab 310.15±7.69ab HBSP低劑量組 10 3418.25±116.36abc 232.03±6.64abc 334.16±9.32abc HBSP中劑量組 10 3397.31±135.42abc 230.13±7.67abc 329.59±9.85abc HBSP高劑量組 10 3207.14±129.74abde 220.16±8.59abde 314.47±6.03abde F值 - 27.307 30.927 62.426 P值 - 0.000 0.000 0.000

圖1 各組大鼠主動脈組織免疫組化圖（×100）

表3 HBSP對各組大鼠新生血管密度的影響（±s）

表3 HBSP對各組大鼠新生血管密度的影響（±s）

注：與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與陽性對照組相比，c P＜0.05；與HBSP低劑量組相比，d P＜0.05；與HBSP中劑量組相比，e P＜0.05

組別 n CD31 MOD對照組 10 0.09±0.01模型組 10 0.31±0.03a陽性對照組 10 0.20±0.02ab HBSP低劑量組 10 0.27±0.01abc HBSP中劑量組 10 0.26±0.02abc HBSP高劑量組 10 0.21±0.03abde F值 - 126.571 P值 - 0.000

圖2 各組大鼠主動脈組織中VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)圖（A：對照組；B：模型組；C：陽性對照組；D：HBSP低劑量組；E：HBSP中劑量組；F：HBSP高劑量組）

表4 HBSP對各組大鼠主動脈組織VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)的影響（±s）

表4 HBSP對各組大鼠主動脈組織VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與陽性對照組相比，c P＜0.05；與HBSP低劑量組相比，d P＜0.05；與HBSP中劑量組相比，e P＜0.05

組別 n VEGF/β-actin VEGFR2/β-actin對照組 10 0.75±0.02 0.83±0.04模型組 10 1.13±0.04a 1.15±0.05a陽性對照 10 0.86±0.03ab 0.87±0.03ab HBSP低劑量組 10 1.02±0.03abc 1.03±0.04abc HBSP中劑量組 10 1.00±0.04abc 1.01±0.02abc HBSP高劑量組 10 0.87±0.02abde 0.89±0.03abde F值 - 193.414 112.937 P值 - 0.000 0.000

3 討論

研究顯示，早發(fā)冠心病患者外周血中hs-CRP、TG水平明顯升高，apoA1、HDL-C水平明顯降低，可作為該病預(yù)測指標(biāo)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，模型組較對照組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，提示冠心病的發(fā)生引起血脂紊亂。HBSP是衍生自促紅細(xì)胞生成素螺旋B結(jié)構(gòu)域的小肽，可保護(hù)組織免受血壓升高和血栓形成的風(fēng)險[11]。Lin等[12]研究顯示，HBSP保留了促紅細(xì)胞生成素的組織保護(hù)特性，且不改變血細(xì)胞比容，有效治療糖尿病性心肌病。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，HBSP低、高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平依次降低，HDL-C水平依次升高，提示HBSP可改善冠心病大鼠機(jī)體血脂水平。

炎癥包括斑塊形成、進(jìn)展、不穩(wěn)定和破裂等過程[13]。CRP是炎癥的生物標(biāo)記物，在動脈粥樣硬化的發(fā)展中積累，可識別和結(jié)合多種內(nèi)在配體來促進(jìn)心血管疾病的進(jìn)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組較對照組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著升高，提示冠心病的發(fā)生造成機(jī)體炎癥反應(yīng)。HBSP具有較好的抗炎特性，Zhang等[15]研究顯示，HBSP在機(jī)體抗炎過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著降低，提示HBSP可緩解冠心病大鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)，與陽性對照組相比，HBSP低、中劑量組鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量顯著升高，高劑量組無顯著變化，提示HBSP的抗炎作用與其劑量有關(guān)且高劑量HBSP與陽性藥物藥效相似。

抑制血管新生是維持脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定的重要途徑，生理狀態(tài)下，血管網(wǎng)存在于動脈壁的外膜、中膜外層，但硬化發(fā)生時，血管平滑肌細(xì)胞活化、增殖，炎癥反應(yīng)加劇，VEGF、VEGFR2等因子被激活，促進(jìn)新生血管增生，新生血管結(jié)構(gòu)不完整，炎性細(xì)胞等活性物質(zhì)侵入新血管增加斑塊的易損性。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組較對照組大鼠主動脈組織中CD31 MOD，VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)顯著升高，提示VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)與冠心病大鼠動脈組織中新生血管增多有關(guān)。與模型組相比，HBSP低、中、高劑量組大鼠主動脈組織中CD31 MOD，VEGF、VEGFR2顯著降低，提示HBSP可抑制VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)，從而抑制動脈組織中血管新生。

綜上所述，HBSP通過抑制VEGF/VEGFR通路，抑制冠心病大鼠血管新生，減少炎性因子分泌，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊。但HBSP的生物活性較多，需進(jìn)一步研究其在心血管疾病中的作用，以其為臨床提供理論基礎(chǔ)。