精索靜脈曲張對孕前男性精漿生化及精子DNA 完整性的影響

阮衍泰 郜 亮 徐貴江 張 坡

1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，揚(yáng)州市婦幼保健院男科（江蘇揚(yáng)州 225002）；2. 揚(yáng)州市邗江區(qū)婦幼保健所男科；3. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，揚(yáng)州市婦幼保健院生殖中心

精索靜脈曲張（varicocele，VC）是男性生殖系統(tǒng)常見病，是手術(shù)可以矯治的導(dǎo)致男性不育的主要原因。 精漿是由前列腺、精囊腺、附睪、尿道球腺等附屬性腺的分泌物混合而成，含有維持精子生存的各種營養(yǎng)成分，是精子運(yùn)動的必須介質(zhì)， 精漿成分的變化可影響精子的功能。 精子DNA 完整性能夠反映出精子DNA 的損傷情況，有效預(yù)測男性人群的精子功能狀況，是一個評價精子質(zhì)量和預(yù)測生育能力的指標(biāo)。 我們對在本院孕前檢查中發(fā)現(xiàn)的精索靜脈曲張患者進(jìn)行了精漿生化和精子DNA 完整性檢測，并對不同曲張程度患者的檢測結(jié)果進(jìn)行了對比分析，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

一、對象及分組

所有對象均來自本院男性孕前檢查門診， 納入標(biāo)準(zhǔn)：身體健康，無煙酒等不良嗜好，無高溫、放射線、輻射、農(nóng)藥及其他化學(xué)毒物接觸史；排除標(biāo)準(zhǔn)：無精子癥、嚴(yán)重少精子癥、精液液化異常、內(nèi)分泌異常、睪丸外傷、生殖道炎癥、病原微生物感染、其它可能影響精漿生化檢測結(jié)果的疾病等。生殖系統(tǒng)檢查發(fā)現(xiàn)有VC 者140 例為VC 組；對照組106 例為體檢無VC 者，兩組間年齡無顯著性差異；VC 組按Valsalva 法分度，Ⅰ度60 例為VCⅠ組，Ⅱ度51 例為VCⅡ組，Ⅲ度29 例為VCⅢ組，雙側(cè)VC 者以較重一側(cè)為準(zhǔn)，三組間年齡無顯著性差異。

二、檢測項目及方法

禁欲4-7 天[1]，手淫法充分射精于一次性采精杯內(nèi)，要求標(biāo)本必須留取完整， 置37℃水浴箱內(nèi)待其自然液化后進(jìn)行各項檢測。 所有試劑均購自深圳博銳德生物科技有限公司，按試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行各項操作。

（一）精子DNA 完整性檢測：精子DNA 完整性檢測用染色質(zhì)擴(kuò)散法（sperm chromatin dispersion，SCD），計算精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）。

（二） 精漿生化檢測： 精液標(biāo)本經(jīng)4000r/min 離心15min 后分離精漿，進(jìn)行精漿生化檢測。 精漿鋅（seminal plasma zinc，Zinc）定量檢測用5-Br-PAPS 顯色法；精漿果糖（seminal plasma fructose，F(xiàn)RU）定量檢測用酶法；精漿α-葡萄糖苷酶（seminal plasma α-glucosidase，α-GLU）定量檢測用改良Cooper 法； 精漿酸性磷酸酶（seminal plasma acid phosphatase，ACP）檢測用對硝基酚磷酸法。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均錄入電腦， 采用SPSS20.0 軟件包處理分析數(shù)據(jù)。 正態(tài)性檢驗采用Shapiro Wilk 檢驗，方差齊性檢驗采用Levene 檢驗，所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，且方差齊性；兩組均數(shù)比較用t 檢驗，三組間均數(shù)比較用單因素方差分析，三組間兩兩比較用SNK 法，以P＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、VC 組和對照組間精漿生化、DFI 均數(shù)比較

與對照組相比，VC 組患者精漿α-GLU 明顯降低（t=2.819，P ＜0.05）， 精 子DFI 明 顯 升 高（t=12.476，P＜0.001）；兩組間精漿Zinc、ACP、FRU 無顯著性差異（t=1.401，P ＞0.05；t=1.018，P ＞0.05；t=0.742，P ＞0.05）（表1）。

表1 VC 組和對照組精漿生化、DFI 均數(shù)比較

二、VC 各組間精漿生化、DFI 均數(shù)比較

VC 組中，隨著VC 曲張程度加重，精漿α-GLU 明顯降低（F=18.469，P＜0.05），三組兩兩間比較有顯著性差異（P＜0.05）；隨著VC 曲張程度加重，精子DFI 明顯升高（F=61.127，P＜0.001），三組兩兩間比較有顯著性差異 （P＜0.05）；VC 各組間精漿Zinc、ACP、FRU 無顯著性差異（F=3.874，P＞0.05；F=2.958，P＞0.05；F=1.786，P＞0.05）（表2）。

表2 VC 各組間精漿生化、DFI 均數(shù)比較

討 論

VC 是男性常見的泌尿外科疾病，與男性不育關(guān)系密切。 VC 導(dǎo)致男性不育的機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全明確。 我們對在本院孕前檢查男性中發(fā)現(xiàn)的精索靜脈曲張患者進(jìn)行了精漿生化和精子DNA 完整性檢測，以探討VC 對男性附性腺功能以及精子DNA 損傷的影響。因禁欲時間對精漿α-GLU 的活性有顯著影響， 禁欲4～7d 的精漿α-GLU 活性比較穩(wěn)定， 顯著高于禁欲2～3d 的精漿α-GLU 活性[1]，故本研究受檢者禁欲時間采用4～7d。

目前氧化應(yīng)激學(xué)說被認(rèn)為是VC 導(dǎo)致不育的重要機(jī)制之一。 氧化應(yīng)激是指當(dāng)氧化物在數(shù)量上超過抗氧化物，形成氧化產(chǎn)物以及這些現(xiàn)象引起的病理效應(yīng)。 活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是指一大類能夠引起氧化應(yīng)激反應(yīng)的物質(zhì)，包括H2O2及外周軌道上含有未配對電子的不穩(wěn)定自由基，如羥自由基、超氧陰離子、 氮自由基等。 總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC) 是指存在于人體中所有對抗ROS 的能力，包括過氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等諸多抗氧化物。 正常生理狀態(tài)下，ROS 和TAC 水平在男性生殖系統(tǒng)中保持著平衡狀態(tài)， 在調(diào)節(jié)正常生精過程、精子運(yùn)動、獲能、頂體反應(yīng)、精卵融合等方面起著重要的作用。 如果ROS 產(chǎn)生過多而TAC 能力下降，氧化程度超過機(jī)體清除能力，體內(nèi)氧化/還原系統(tǒng)之間的平衡被破壞，就產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起脂質(zhì)過氧化損傷精子膜，損害生精細(xì)胞和精子的抗氧化防御措施，最終導(dǎo)致精子受損、男性不育。

VC 時由于血睪屏障受損、血流微循環(huán)障礙、局部內(nèi)環(huán)境缺氧，細(xì)胞在缺氧環(huán)境下進(jìn)行無氧酵解，大量分解ATP， 其分解產(chǎn)物次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶作用下產(chǎn)生大量ROS[2]，過量的ROS 超過了機(jī)體的氧化平衡能力時，啟動了細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化，進(jìn)而生成了大量的脂質(zhì)過氧化物，對精子質(zhì)膜進(jìn)行攻擊，致使生精細(xì)胞及精子DNA 單鏈、雙鏈發(fā)生斷裂，破壞了精子DNA 的完整性[3]。已有研究[4]發(fā)現(xiàn)VC 不育患者精子DNA 損傷水平以及氧化應(yīng)激程度較高，導(dǎo)致DFI 升高，且VC 不育患者精漿ROS 水平與DFI 呈顯著正相關(guān)關(guān)系[5]。 動物實驗發(fā)現(xiàn)[6]，VC 大鼠睪丸組織勻漿中SOD、CAT 活性下降，并且臨床已證實[7]VC 患者精漿TAC 水平下降，說明VC 時生殖系統(tǒng)抗氧化能力下降，意味著對ROS清除能力下降，體內(nèi)氧化/ 還原系統(tǒng)之間失衡加劇，精子DNA 損傷加重。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)VC 組DFI 明顯高于對照組，有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異（t=12.476，P＜0.001），證實VC 的確能引起精子DNA 損傷。 我們認(rèn)為，正是由于VC 患者體內(nèi)ROS 過度生成， 并且同時伴有抗氧化能力下降，這兩方面因素共同作用的結(jié)果導(dǎo)致了VC患者DFI 明顯升高，而DNA 損傷反過來也可誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，兩者相互作用、相互促進(jìn)，最終導(dǎo)致機(jī)體進(jìn)一步的氧化損傷。

8- 羥基脫氧鳥苷 (8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG)作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，可對機(jī)體出現(xiàn)的過氧化反應(yīng)程度以及機(jī)體內(nèi)ROS 生成程度進(jìn)行有效反應(yīng)，其水平的高低可對精子質(zhì)膜產(chǎn)生影響，從而影響到精子質(zhì)量。 康然[8]等研究發(fā)現(xiàn)，隨著VC 曲張程度的加重，患者的8-OHdG 水平呈逐漸升高趨勢，說明隨著VC 曲張程度的加重體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)逐步加重；而謝勝[9]等通過對VC 不育患者精漿TAC 水平檢測，證實隨著VC 曲張程度越重，其TAC 水平越低，機(jī)體抗氧化能力逐步下降。 這就導(dǎo)致了隨著VC 曲張程度的加重，患者的DNA 損傷嚴(yán)重程度也越來越高。 本研究探討了不同曲張程度與DFI 之間的關(guān)系， 發(fā)現(xiàn)隨著曲張嚴(yán)重程度的增加DFI 逐步升高（F=61.127，P＜0.001），三組兩兩間比較也具有顯著性差異（P＜0.05），提示VC 與精子DNA 損傷可能存在線性關(guān)系，即VC 曲張嚴(yán)重程度越嚴(yán)重，精子DNA 損傷越嚴(yán)重。

精漿是精子賴以存活的載體，主要由前列腺、精囊腺、附睪和尿道球腺等腺體的分泌物組成，一旦這些腺體功能發(fā)表改變，即可能不同程度地影響到精液質(zhì)量。因此， 精漿生化檢查對評估附屬性腺的功能以及研究附屬性腺對男性生育的影響有重要意義。 睪丸中產(chǎn)生的精子已經(jīng)達(dá)到形態(tài)學(xué)上的成熟， 輸送到附睪后獲得了前向運(yùn)動和受精能力。 精漿α-GLU 是反映附睪功能的指標(biāo)之一，由附睪上皮細(xì)胞合成和分泌形成，可通過催化多糖或糖蛋白中的碳水化合物分解為葡萄糖，從而為精子基本代謝、成熟、獲能、運(yùn)動和受精提供能源。本研究結(jié)果顯示，VC 組精漿α-GLU 明顯低于對照組（t=2.819，P＜0.05）， 并且 隨 著VC 曲 張 程 度 的 增 加α-GLU 含量明顯下降（F=18.469，P＜0.05），三組兩兩間比較也具有顯著性差異（P＜0.05），其原因可能由于附睪大部分血液循環(huán)與睪丸同源，VC 改變了附睪的血流動力學(xué)，引起附睪組織低氧、附睪組織細(xì)胞凋亡加速，最終導(dǎo)致附睪功能降低[10]。 還有研究發(fā)現(xiàn)[11]VC 可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致附睪上皮緊密連接蛋白ZO-1 表達(dá)下降引起附睪上皮損傷，是VC 導(dǎo)致附睪功能受損的重要位點(diǎn)。

精液中的Zinc 主要源自前列腺， 為前列腺的特征性產(chǎn)物，可間接反映前列腺的功能。精漿Zinc 是多種酶的輔酶，是維持精子功能活動的重要微量元素之一；精漿FRU 來自于精囊腺， 是由血液中葡萄糖在精囊中通過酶促轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的單糖，是精子主要的糖類來源，可用于監(jiān)測精囊和睪丸間質(zhì)細(xì)胞的功能；精漿ACP 主要由前列腺腺管上皮細(xì)胞分泌， 主要作用是催化磷酸酯鍵水解， 在精液中含量的變化能反應(yīng)前列腺的分泌功能，并有助于前列腺疾病的診斷。 本研究未能發(fā)現(xiàn)精漿Zinc、FRU、ACP 與VC 的關(guān)系，表明VC 可能不影響前列腺、精囊腺的功能。

由于本研究對象均來自孕前檢查健康體檢者，不同于以往研究中的不育患者， 因此可能存在一定的選擇性偏倚，對研究結(jié)果可能會造成一定的影響。 但本研究結(jié)果仍提示VC 能引起附睪功能下降、 導(dǎo)致精子DNA 損傷，并且隨著VC 曲張程度的加重，附睪功能下降越嚴(yán)重，精子DNA 的損傷也越嚴(yán)重。 目前手術(shù)是治療精索靜脈曲張的主要方法，但術(shù)后精子質(zhì)量改善、配偶的懷孕率等情況仍不能令人滿意。 結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為VC 手術(shù)治療后配合藥物治療，有利于調(diào)整附睪功能、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]，從而改善患者的精子質(zhì)量，提高生育力。