miR-95-5p靶向BMP2調(diào)控脂肪干細(xì)胞成骨分化的作用及機(jī)制*

孟祥偉， 鄭 峰

1青海大學(xué)研究生院，西寧 8100162 青海省人民醫(yī)院骨科，西寧 810007

組織工程技術(shù)是近年來興起的骨缺損修復(fù)手段，干細(xì)胞是組織工程技術(shù)中重要的種子細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的潛能，在特定條件下能夠向成骨細(xì)胞分化并對骨缺損進(jìn)行修復(fù)[1-2]。脂肪干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是組織工程領(lǐng)域常用的間充質(zhì)干細(xì)胞，從脂肪組織分離得到，具有來源廣泛、生物相容性良好等優(yōu)勢，能夠向成骨細(xì)胞分化，但調(diào)控ADSCs成骨分化的機(jī)制尚不十分清楚，這也限制了ADSCs在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用價值。

微小RNA(microRNA，miR)是近年受到越來越多關(guān)注的一類非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多個生物學(xué)環(huán)節(jié)中發(fā)揮調(diào)控作用。多項(xiàng)組織工程相關(guān)的研究證實(shí)，miRs對ADSCs、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等的成骨分化、成脂分化具有調(diào)控作用[3-5]。另有一項(xiàng)關(guān)節(jié)軟骨的相關(guān)研究表明，miR-95-5p對間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化具有調(diào)節(jié)作用[6]，但miR-95-5p在干細(xì)胞成骨分化中的作用未見報道。經(jīng)前期生物信息學(xué)分析，miR-95-5p對成骨過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)具有靶向調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以ADSCs為對象，具體分析了miR-95-5p靶向BMP2調(diào)控ADSCs成骨分化的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物 雄性C57BL/6小鼠購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司，體質(zhì)量18～25 g，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2018-0004。

1.1.2 試劑 Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶購自Gibco公司；陰性對照(negative control，NC)mimic，miR-95-5p mimic購自上海吉瑪公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、流式細(xì)胞術(shù)試劑盒及CD44、CD90、CD105、CD45抗體購自Thermo公司；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅購自Sigma公司；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒，BMP2、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)一抗購自Abcam公司；BMP2基因熒光素酶報告基因及檢測試劑盒購自Promega公司。

1.1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀為Thermo公司產(chǎn)品，多功能酶標(biāo)儀為北京普朗新技術(shù)公司產(chǎn)品，凝膠成像儀為上海金鵬分析儀器公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ADSCs的分離培養(yǎng) C57BL/6小鼠處死并取腹股溝脂肪組織，剪碎后加入0.2%Ⅰ型膠原酶，消化50 min，1000 r/min離心8 min后收集沉淀，磷酸鹽緩沖液清洗并離心，用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液重懸，接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，每2～3天換液1次。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底層80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代繼續(xù)培養(yǎng)。取第3代PDLSCs進(jìn)行鑒定，4℃避光孵育CD44、CD90、CD105、CD45抗體1 h后，在流式細(xì)胞儀上檢測上述抗體的表達(dá)情況。

1.2.2 ADSCs的分組及轉(zhuǎn)染 取第3代ADSCs進(jìn)行分組。miR-NC組轉(zhuǎn)染NC mimic，miR-95-5p轉(zhuǎn)染miR-95-5p mimic，轉(zhuǎn)染均采用Lipofectamine2000進(jìn)行，按照試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.3 成骨誘導(dǎo)分化 配置成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，即含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10%胎牛血清的培養(yǎng)液(α-MEM)。ADSCs分組轉(zhuǎn)染后24 h，將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)分化過程中，每2天更換1次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。誘導(dǎo)分化后第3、5、7天時，收集細(xì)胞并進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)及Western blot檢測；誘導(dǎo)分化第14天時，收集細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色。

1.2.4 ALP活力及ALP染色的檢測 收集ADSCs，用ALP檢測試劑盒測定細(xì)胞中ALP的活力，用BCA試劑盒測定細(xì)胞中的總蛋白含量，而后計(jì)算每毫克蛋白對應(yīng)的ALP活力。另外采用多聚甲醛室溫固定20 min，棄多聚甲醛后，每孔加入大約200 μL染液進(jìn)行ALP染色，避光30 min，觀察染色結(jié)果。

1.2.5 鈣結(jié)節(jié)的茜素紅染色 用75%乙醇固定ADSCs 30 min，磷酸鹽緩沖液漂洗3次后用0.1%茜素紅在37℃染色30 min，在顯微鏡下觀察染色情況；加入10%氯化十六烷基吡啶500 μL，充分溶解鈣結(jié)節(jié)，混勻后取50 μL液體加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，在酶標(biāo)儀上檢測570 nm波長的吸光度(A570nm)。

1.2.6 miR-95-5p表達(dá)的檢測 ADSCs按1.2.2項(xiàng)的方法分組轉(zhuǎn)染后24 h進(jìn)行miR-95-5p表達(dá)的檢測，首先，按照miR提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作，提取組織中的miR；而后按照miR cDNA第一鏈合成試劑盒的說明書進(jìn)行操作，將組織中的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；最后，按照miR熒光定量PCR檢測試劑盒配置PCR反應(yīng)體系，分別使用目的基因miR-95-5p及內(nèi)參基因U6的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min后95℃15 s及60℃34 s，重復(fù)40個循環(huán)。反應(yīng)完成后，軟件中自動生成反應(yīng)的循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以U6為內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-95-5p的表達(dá)量。

1.2.7 蛋白表達(dá)的檢測 收集ADSCs，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞中的蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白含量，取含有30 μg蛋白的樣本進(jìn)行Western blot檢測，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳以分離蛋白，而后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，在5%脫脂牛奶中封閉PVDF膜1 h，在Runx2、OCN、BMP2、β-actin一抗中孵育過夜。次日，室溫孵育二抗2 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，用Image J軟件掃描蛋白條帶的灰度值，按照目的蛋白灰度值/β-actin灰度值計(jì)算Runx2、OCN、BMP2的蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn) 將BMP2熒光素酶報告基因與NC mimic或miR-95-5p mimic共轉(zhuǎn)染進(jìn)入ADSCs，24 h后用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分別測定細(xì)胞中螢火蟲熒光活力及海腎熒光活力，按照公式(螢火蟲熒光活力/海腎熒光活力)計(jì)算雙熒光素酶報告基因的熒光活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ADSCs干細(xì)胞特征的鑒定

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，ADSCs表面CD105、CD29、CD44的陽性表達(dá)率均在98%以上，CD45的陽性表達(dá)率低于1%，說明ADSCs符合間充質(zhì)來源干細(xì)胞的特性。見圖1。

圖1 ADSCs表面CD105、CD29、CD44、CD45的陽性表達(dá)率Fig.1 The positive expression rates of CD105，CD29，CD44 and CD45 on the surface of ADSCs

2.2 miR-95-5p mimic的轉(zhuǎn)染效率及ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后miR-95-5p的表達(dá)

ADSCs成骨誘導(dǎo)分化前及分化過程中，與空白對照組比較，miR-NC組ADSCs中miR-95-5p的表達(dá)水平無明顯差異(均P>0.05)；與miR-NC組比較，miR-95-5p組ADSCs中miR-95-5p表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 miR-95-5p mimic的轉(zhuǎn)染效率及ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后miR-95-5p的表達(dá)Table 1 Comparison of miR-95-5p expression before and after osteogenic differentiation of ADSCs among three groups

2.3 miR-95-5p對ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后ALP活力及ALP染色的影響

與空白對照組比較，miR-NC組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后第3、5、7天時的ALP活力及ALP染色無明顯差異(均P>0.05)；與miR-NC組比較，miR-95-5p組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后第3、5、7天時的ALP活力及ALP染色明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2和圖2。

表2 各組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后ALP活力的比較Table 2 Comparison of ALP activity after osteogenic differentiation of ADSCs among three

圖2 各組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后ALP染色比較(×100)Fig.2 Comparison of ALP staining after osteogenic differentiation of ADSCs among three groups(×100)

2.4 miR-95-5p對ADSCs成骨誘導(dǎo)分化的鈣結(jié)節(jié)水平的影響

與空白對照組比較，miR-NC組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后第14天時鈣結(jié)節(jié)形成無明顯差異(均P>0.05)；與miR-NC組比較，miR-95-5p組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后第14天時的A570nm值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和圖4。

圖3 各組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后的茜素紅染色圖Fig.3 Comparison of alizarin red staining of ADSCs after osteogenic differentiation among three groups

與miR-NC組比較，*P<0.05

2.5 miR-95-5p對ADSCs中成骨標(biāo)志基因Runx2、OCN蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，miR-NC組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后第6天時細(xì)胞中Runx2、OCN的表達(dá)水平無明顯差異(均P>0.05)；與miR-NC組比較，miR-95-5p組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后第6天時細(xì)胞中Runx2、OCN的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見圖5、表3。

圖5 各組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后Runx2、OCN的蛋白條帶Fig.5 Runx2 and OCN protein expression in ADSCs after osteogenic differentiation

表3 各組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后Runx2、OCN蛋白表達(dá)水平的比較Table 3 Comparison of Runx2，OCN expression levels after osteogenic differentiation of ADSCs in three

2.6 miR-95-5p對ADSCs中BMP2的靶向調(diào)節(jié)作用

經(jīng)Targetscan數(shù)據(jù)庫分析，BMP2基因mRNA 3′UTR中有miR-95-5p的結(jié)合位點(diǎn)，見圖6；與miR-NC組比較，miR-95-5p組ADSCs成骨誘導(dǎo)分化后第6天時細(xì)胞中BMP2的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖7、表4；與miR-NC組比較，miR-95-5p組ADSCs中野生型BMP2熒光素酶報告基因的熒光活力明顯降低(P<0.05)、突變型BMP2熒光素酶報告基因的熒光活力無明顯變化(P>0.05)，見表4。

圖6 BMP2基因mRNA 3′UTR中miR-95-5p的結(jié)合位點(diǎn)Fig.6 Binding site of miR-95-5p in BMP2

圖7 各組ADSCs中BMP2的蛋白條帶Fig.7 Protein bands of BMP2 in ADSCs of three groups

表4 各組ADSCs中BMP2表達(dá)水平及熒光素酶報告基因熒光活力的比較Table 4 Comparison of BMP2 expression level and luciferase reporter gene fluorescence activity in ADSCs among three

3 討論

ADSCs是組織工程領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞，不僅具有自我更新及多向分化的干細(xì)胞特性，還具有取材來源豐富、生物相容性良好的優(yōu)點(diǎn)，其在骨缺損修復(fù)、組織缺血再灌注損傷中的應(yīng)用價值受到了越來越多重視。骨缺損修復(fù)一直是骨科研究關(guān)注的熱點(diǎn)，在骨缺損修復(fù)過程中，ADSCs通過向成骨細(xì)胞的分化來發(fā)揮治療作用，是骨科治療骨缺損的理想材料[7]。由于ADSCs的成骨分化受到多種理化因素的影響，如何調(diào)控ADSCs定向分化為成骨細(xì)胞成為影響ADSCs用于骨缺損修復(fù)治療效果的重要因素。

miR是組織工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)分子，長度約18～25 bp，且不具備編碼氨基酸的功能，其生物學(xué)功能是與靶基因mRNA 3′UTR結(jié)合并使基因表達(dá)沉默，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖、凋亡、分化等的調(diào)控。骨科相關(guān)的研究表明，miR-95-5p能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化[6]；另有研究表明，miR-95-5p還能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的肌源性分化[8]。由此推斷，miR-95-5p在干細(xì)胞向成體細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮了一定的調(diào)控作用，但其在干細(xì)胞成骨分化過程中的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)在分離ADSCs后，通過轉(zhuǎn)染miR-95-5p mimic的方式增加了細(xì)胞中miR-95-5p的表達(dá)量，而后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化并發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)miR-95-5p后成骨誘導(dǎo)分化的鈣結(jié)節(jié)明顯減少，表明miR-95-5p能夠抑制ADSCs的成骨分化。

在干細(xì)胞成骨分化的過程中，ALP的活力不斷增強(qiáng)并介導(dǎo)了骨質(zhì)礦化的過程，因此ALP活力是評價成骨分化的重要指標(biāo)之一[9]。本實(shí)驗(yàn)在過表達(dá)miR-95-5p并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞中ALP的活力及染色明顯降低，與茜素紅染色觀察到鈣結(jié)節(jié)數(shù)目減少的結(jié)果吻合，進(jìn)一步確認(rèn)了miR-95-5p抑制ADSCs成骨分化的作用。Runx2和OCN是成骨細(xì)胞的標(biāo)志基因，前者是促進(jìn)成骨的轉(zhuǎn)錄因子，后者是成熟骨質(zhì)中主要的非膠原成分[10-12]，本實(shí)驗(yàn)觀察到：過表達(dá)miR-95-5p并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化后細(xì)胞中Runx2和OCN的表達(dá)水平明顯降低，表明miR-95-5p能夠抑制ADSCs中成骨標(biāo)志基因的表達(dá)，進(jìn)而驗(yàn)證了miR-95-5p抑制ADSCs成骨分化的作用。

在干細(xì)胞向成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞分化的過程中，miR-95-5p并不直接影響干細(xì)胞的分化，而是通過調(diào)控不同靶基因的表達(dá)來影響干細(xì)胞的分化。前期在Targetscan數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，BMP2是miR-95-5p的潛在靶基因之一。BMP2是目前已知與成骨分化調(diào)控關(guān)系最密切的基因之一，已有研究表明，過表達(dá)BMP2能夠促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化[13-14]，而敲低BMP2能夠抑制干細(xì)胞的成骨分化[15]。本實(shí)驗(yàn)在前期生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了miR-95-5p對ADSCs中BMP2的調(diào)節(jié)作用并發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)miR-95-5p并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化后細(xì)胞中BMP2的表達(dá)水平明顯降低。在轉(zhuǎn)染野生型BMP2的熒光素酶報告基因后，miR-95-5p能夠降低熒光活力；而在根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果對野生型熒光素酶報告基因進(jìn)行突變后，miR-95-5p不再影響熒光活力。以上結(jié)果表明miR-95-5p能夠靶向抑制ADSCs中BMP2的表達(dá)，且miR-95-5p的靶向位點(diǎn)與前期生物信息學(xué)預(yù)測一致，進(jìn)而提示靶向抑制BMP2基因可能是miR-95-5p抑制ADSCs成骨分化的分子機(jī)制之一。

綜上所述，miR-95-5p對ADSCs的成骨分化具有抑制作用，靶向BMP2基因是可能的分子機(jī)制，miR-95-5p可能成為研究ADSCs成骨分化調(diào)控機(jī)制的新靶點(diǎn)，抑制miR-95-5p也有望成為促進(jìn)ADSCs成骨分化的治療手段。