P210抗體減輕內(nèi)皮損傷抑制動脈粥樣硬化*

李松海， 曾狀林， 冮洪生 △， 魏宇淼 △

1武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 4300332華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430022

動脈粥樣硬化性心腦血管病死亡占我國城鄉(xiāng)人口死亡的40%以上，雖然現(xiàn)有的診治措施取得了較好的臨床效果，但這一疾病所造成的人群死亡數(shù)目仍在上升[1]。動脈粥樣硬化的發(fā)生機制復雜，主流觀點是血管壁在高脂狀態(tài)下過度的脂質(zhì)沉積以及血管壁對脂質(zhì)成分的慢性進展性炎癥反應，動脈粥樣硬化的形成與脂質(zhì)代謝異常關系密切[2]。

血管壁膽固醇沉積及血管壁相關細胞功能損害是動脈粥樣硬化血管損害的核心發(fā)病機制[3-4]，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受體廣泛存在于肝、動脈壁細胞等全身各組織的細胞膜表面，當血漿中LDL與其受體結合后，受體聚集成簇，內(nèi)吞入細胞與溶酶體融合。但隨著細胞內(nèi)膽固醇水平的上升，細胞通過下調(diào)LDL受體功能，以避免膽固醇的過量沉積。組成LDL的載脂蛋白B(ApoB)分子巨大(包含4536個氨基酸殘基)，1分子ApoB可與大約700個磷脂分子、600個游離膽固醇分子、1600個膽固醇酯分子、185個三酰甘油形成一個復雜的蛋白-脂質(zhì)組合體，在機體復雜的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)下極易氧化，在一氧化氮合成酶(NOS)及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase，Nox)及髓過氧化物酶(MPO)的作用下，形成氧化型LDL(Ox-LDL)，產(chǎn)生大量抗原決定簇的改變[5]。因LDL的氧化及其抗原決定簇的改變而產(chǎn)生氧化反應特異性表位(oxidation-specific epitope，OSE)，使得機體炎癥相關吞噬細胞、血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞可以通過其固有的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)對Ox-LDL進行吞噬，這類受體在巨噬細胞突出表現(xiàn)為類型眾多的清道夫受體(scavenger receptor，SR)和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)[6]。清道夫受體現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10余種，包括A類清道夫受體SRA1及SRA2(SRA，識別富含半胱氨酸結構域)、B類清道夫受體如SR-BI及CD36，以及主要表達于血管內(nèi)皮細胞的E類清道夫受體(清道夫受體血凝素結構域)即血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1)。內(nèi)皮細胞主要通過LOX-1進行Ox-LDL的結合、吞噬、降解并引起內(nèi)皮細胞功能障礙和相關損害。因此如何減輕Ox-LDL通過LOX-1誘導的內(nèi)皮屏障受損，維持良好的內(nèi)皮細胞生存狀態(tài)對防治動脈粥樣硬化具有重要意義。

大量研究表明以Ox-LDL及其載脂蛋白片段進行主動免疫可以有效減少動脈粥樣硬化病變，其中特異性片段P210在ApoE基因敲除小鼠模型中的保護效果尤為突出，但具體機制尚未闡明[7]。基于此我們通過構建體外模型探究特異性P210抗體保護內(nèi)皮細胞減輕動脈粥樣硬化的機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)由教育部分子靶向治療重點實驗室(心血管免疫實驗室)提供。ECM培養(yǎng)液及血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自Amresco公司，Hoechest 33258購自碧云天公司，Bax、Bcl-2、ZO-1抗體購自Cell Signaling Technology公司，內(nèi)參GAPDH、β-actin抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。牛血清白蛋白、油紅染液、DAPI染液、Calcein Am染液購自武漢谷歌生物科技有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒(BD，美國)購自上海優(yōu)寧維公司，BCA蛋白檢測試劑盒均購于Pierce公司，Cocktail混合蛋白酶抑制劑、全蛋白裂解液購自武漢安特捷公司，Western配膠試劑盒購自碧云天生物技術公司，Ox-ApoB特異性多肽片段P210合成及其特異性抗體的制備、提純由武漢安特捷生物有限公司輔助完成，5%脫脂牛奶、甲醇、異丙醇、氯仿、無水乙醇、10 ×麗春紅溶液等輔助試劑均購自武漢谷歌、大風或安特捷生物有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組

細胞培養(yǎng)于專用的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液ECM中，均置于21%O2、5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。用含1%～2% FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h(饑餓處理)后，將細胞分為3組，對照組：未加Ox-LDL和Ab(P210抗體)；Ox-LDL組：分別加入25、50及100 μg/mL Ox-LDL(3個亞組)；Ox-LDL+Ab組：在50 μg/mL Ox-LDL存在下，分別加入100和200 ng/mL Ab(2個亞組)。

1.3 流式細胞術檢測

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒檢測HUVEC細胞的凋亡：①10× Binding Buffer用ddH2O稀釋成1× Binding Buffer；②用不含EDTA的0.25%的胰酶消化HUVEC(EDTA會與Ca離子螯合，影響Annexin Ⅴ的結合)，顯微鏡下密切監(jiān)測消化程度，避免過度消化。室溫下離心(1000 r/min，5 min)，收集細胞；③用4℃預冷的1×PBS緩沖液重懸細胞，離心(1000 r/min，5 min)，重復上述操作1次；④用1× Binding Buffer重懸細胞，調(diào)整細胞密度至1×106/mL，取200 μL細胞懸液至流式管中；⑤每管加入5 μL Annexin Ⅴ，混勻，室溫避光孵育15 min；⑥流式上機前5 min加入5 μL PI避光染色，上機前酌情補加適量1× Binding Buffer。

1.4 Western blot檢測細胞Bax、Bcl-2、ZO-1蛋白的表達

將培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)板中吸出，每孔加入100 μL混有蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，轉(zhuǎn)入4℃預冷EP管中振蕩裂解，離心，測濃度，分裝。跑膠，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜。將PVDF膜浸沒于TBST配制的5%脫脂牛奶溶液中，室溫下?lián)u床封閉2 h左右。加入一抗稀釋液(稀釋度1∶1000，根據(jù)抗體說明書調(diào)整)，冰上搖勻1～2 h，4℃冰箱過夜。TBST洗滌10 min × 3次。加入HRP標記的稀釋二抗，室溫孵育2 h。棄掉二抗溶液，TBST洗滌10 min × 3次。準備ECL溶液，溶液A與溶液B等體積混勻，現(xiàn)配即用。將ECL溶液均勻加于膜上，室溫1 min。去除ECL溶液，Bio-Rad化學發(fā)光儀檢測，Image Lab軟件計算蛋白條帶灰度值。

1.5 細胞免疫熒光檢測ZO-1的表達

不同處理組的細胞爬片用PBS清洗，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗后10%山羊血清封閉30 min。加入適量PBS稀釋的相應一抗，放入濕盒內(nèi)4℃過夜。常溫復溫1 h，PBS清洗5 min × 3次。加入PBS稀釋的熒光標記二抗，常溫孵育1 h。PBS清洗5 min × 3次。DAPI復染核5 min，滴加防熒光淬滅封片劑封片。避光4℃放置，24 h內(nèi)拍照儲存。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 P210抗體可以減少Ox-LDL所致內(nèi)皮細胞凋亡壞死

流式細胞術檢測顯示(圖1A)：與對照組(a)比較，Ox-LDL可引起原代HUVEC凋亡壞死，并隨Ox-LDL濃度增加(25，50，100μg/mL)呈梯度變化，P210抗體可以減少該變化。Western blot檢測顯示(圖1B)：促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2比值隨著Ox-LDL濃度增加而表達增加，且這一作用可被P210抗體所改善。說明Ox-LDL可誘導內(nèi)皮細胞凋亡壞死，P210抗體可抑制這一作用。

2.2 P210抗體可以減少內(nèi)皮細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積

激光共聚焦示：紅色熒光探針Dil標記的Ox-LDL可被內(nèi)皮細胞(鈣黃綠素Calcein Am活體染色)吞噬，沉積于細胞質(zhì)內(nèi)，P210抗體可以減少內(nèi)皮細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積(圖2)。

與Ox-LDL組比較，**P<0.01

2.3 P210抗體能減輕Ox-LDL對內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白表達的抑制作用

激光共聚焦及Western blot檢測示：Ox-LDL可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白ZO-1的表達，P210抗體處理能顯著減輕該抑制效應。說明抗體對Ox-LDL所引起的內(nèi)皮細胞緊密連接破壞亦有保護效應(圖3)。

與對照組比較，**P<0.01；與Ox-LDL(50 μg/mL)組比較，##P<0.01

3 討論

動脈粥樣硬化性疾病給人類的健康帶來極大的危害，對其發(fā)病機制進行深入研究有助于對其更好地進行干預。在動脈粥樣硬化研究中，越來越多的研究表明脂質(zhì)沉積及氧化應激誘導的持續(xù)炎癥反應在粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[8]，研究者常常更關注動脈粥樣硬化的主要病理改變，即泡沫細胞、膽固醇核心的形成以及纖維帽的厚薄，這些與巨噬細胞和平滑肌細胞的病理反應關系密切，而血管內(nèi)皮細胞作為保護血管的第一道屏障在動脈粥樣硬化的形成中更是具有核心地位[9]。

生理狀況下，血管內(nèi)皮通過縫隙連接、緊密連接及粘附連接形成單層細胞結構。正常情況下內(nèi)皮細胞通過穿胞機制及細胞間隙允許一些小分子和液體等穿過，循環(huán)中清蛋白、LDL等不易透過內(nèi)皮屏障。在高血脂、高血壓、吸煙等誘因下，循環(huán)中LDL不斷地通過脂氧合酶及髓過氧化物酶等途徑形成Ox-LDL[10]。資料表明，相較于LDL，Ox-LDL在動脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展中起著更為關鍵的作用[11]。Ox-LDL顆粒的受體不具有下調(diào)功能，從而造成脂質(zhì)的過度沉積，同時吞噬的脂質(zhì)不能在細胞內(nèi)完全降解，可促使炎癥反應激活和內(nèi)皮細胞等血管壁細胞的應激及損害。Ox-LDL經(jīng)LOX-1途徑損害內(nèi)皮屏障功能，導致脂質(zhì)向內(nèi)皮下浸潤并增加脂質(zhì)穿胞作用，進而導致內(nèi)皮細胞生存狀態(tài)惡化是動脈粥樣硬化及相關損害的關鍵因素[12-13]。循環(huán)中的Ox-LDL約占循環(huán)中LDL的10%左右。Ox-LDL可以通過內(nèi)皮細胞表面LOX-1受體在血管內(nèi)皮細胞中沉積并引起一系列不良后果[14]。

本研究結果顯示P210抗體干預可以減輕內(nèi)皮細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，使促凋亡蛋白Bax表達相對減少、抗凋亡蛋白Bcl-2表達相對增多，抑制內(nèi)皮細胞死亡，從而保護內(nèi)皮屏障功能。本研究還發(fā)現(xiàn)P210抗體可以增加內(nèi)皮緊密連接蛋白ZO-1表達，減少內(nèi)皮連接屏障的破壞，從而減少Ox-LDL在內(nèi)皮細胞下沉積，減輕內(nèi)皮細胞生理功能的損傷。因此，我們認為，P210抗體可以減少氧化脂質(zhì)在內(nèi)皮細胞下沉積，減少內(nèi)皮細胞凋亡，保護內(nèi)皮屏障，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

我們的研究尚存在許多不足之處，后續(xù)的實驗需要利用ApoE基因和LOX-1基因敲除小鼠進行更細致完善的探索和驗證。我們認為，以免疫干預的方式對動脈粥樣硬化病變的初始環(huán)節(jié)進行干預是一個很有前景的研究方向。

綜上所述，針對氧化脂質(zhì)特異性抗原表位的P210抗體可以減輕氧化脂質(zhì)在內(nèi)皮細胞內(nèi)的沉積，減少內(nèi)皮細胞的損傷，保護內(nèi)皮連接蛋白的正常表達從而維持內(nèi)皮屏障完整性，從初始環(huán)節(jié)減輕動脈粥樣硬化的發(fā)展，但其具體機制還需進一步的深入研究。