B6-Co 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及HSP70表達(dá)研究

姬桂青邱 天景 瑾朱順星邵義祥*

(1.南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南通 226001； 2.華東師范大學(xué)第二附屬中學(xué),上海 201203；3.南通大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所,江蘇 南通 226001)

先天性的角膜混濁(congenital corneal opacities,CCO)在新生兒中患病率只有1.4‰,雖然罕見(jiàn)但患病嚴(yán)重易致盲,如不能得到診治,將會(huì)導(dǎo)致弱視,影響新生兒的視覺(jué)發(fā)育,或者波及其全身發(fā)育(引發(fā)生長(zhǎng)遲緩等)[1]。 因此能夠及早發(fā)現(xiàn)并治療CCO,具有重要意義。 一般研究認(rèn)為常見(jiàn)的CCO 病因主要有兩種:一是外胚葉發(fā)育障礙性的角膜混濁,由于外胚葉的晶狀體和囊泡不能正常地分離外胚葉；二是炎癥引起角膜混濁(母體內(nèi)血液或羊水感染)[2]。 前一種發(fā)育障礙主要是常染色體顯性遺傳因素導(dǎo)致,但深入機(jī)制尚不明確,這與先天性眼瞼閉合不全(eyelid open at birth,EOB)模型鼠[3]的現(xiàn)象極為相似。

EOB 小鼠在出生時(shí)眼瞼開(kāi)放,這種異?，F(xiàn)象可能是導(dǎo)致后代小鼠眼部疾患的重要原因[4]。 有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)ENU 誘變建立的B6-Co 突變系小鼠即具有EOB 特征[5-7]。 兩種小鼠角膜組織全蛋白二維凝膠電泳結(jié)果顯示,相比C57BL/6 小鼠(以下簡(jiǎn)稱:B6 小鼠),B6-Co 小鼠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)點(diǎn)顯著上調(diào)的有6 個(gè),顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有13 個(gè),其中HSP70 下調(diào)最為顯著[8]。 熱休克蛋白70(HSP70)是熱休克蛋白家族中被研究最多的一種,尤其是對(duì)HSP70 家族的結(jié)構(gòu)、功能以及表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究較多[9-10],HSP70 在細(xì)胞的周期調(diào)控[11]、胚胎發(fā)育[12-14]、衰老中具有重要的生物學(xué)功能[15]。而前期實(shí)驗(yàn)[8]檢測(cè)兩種老鼠眼瞼組織內(nèi)HSP70 蛋白表達(dá)差異性顯著,所以HSP70 與B6-Co 小鼠EOB表型出現(xiàn)可能存在聯(lián)系。

因此,本實(shí)驗(yàn)選取從突變系B6-Co 小鼠和正常B6 小鼠(取18.5 d 孕鼠腹中胚胎)中取材培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞[16-20],驗(yàn)證HSP70 在兩種細(xì)胞中的含量是否存在差異,通過(guò)小干擾敲低B6 成纖維細(xì)胞HSP70 表達(dá),檢測(cè)其遷移能力變化。 為體外驗(yàn)證HSP70 的表達(dá)能否調(diào)控兩種細(xì)胞的生物學(xué)行為提供前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠雌鼠20 只、雄鼠10 只(18～22 g,誤差小于10%)以及其突變系B6-Co 小鼠(SPF 級(jí),18 ～22 g 誤差小于10%)雌鼠10 只、雄鼠5 只,選用小鼠均為8 周齡,均由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(蘇)2019-0001]。 前期實(shí)驗(yàn)取材于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(蘇)2017-0045]完成。 實(shí)驗(yàn)鼠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)屏障動(dòng)物房?jī)?nèi),室內(nèi)溫度(21 ± 1)℃,相對(duì)濕度(55 ± 5)%,自由采食和自由飲水,晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h,定期更換籠具、墊料,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利要求,獲得南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC:20180808-001)。 B6 雄性與B6雌性小鼠以1 ∶2比例配對(duì),共5 籠；B6-Co 雄性小鼠與B6 雌性或B6 雄性與B6-Co 雌性小鼠以1 ∶2比例配對(duì),共5 籠。 每天早上8 點(diǎn)前檢栓,見(jiàn)栓當(dāng)日胚齡記為0.5 d。

1.2 主要試劑與儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)；倒置相差顯微鏡(Leica)；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche,REF:04897030001)；0.25% 胰蛋白酶(含EDTA)(Hyclone)、總RNA 提取試劑(TRIzol)(生工,Lot:FB06KB3578)；SDS - PAGE Preparation kit凝膠試劑盒(生工,C631100-0200)；GAPDH 一抗(Abcam,ab9485)；HSP70 一抗(Abcam,ab2787)；lysis buffer(生工,G301DB0009)；胎牛血清,FBS(Gibico,美國(guó))；DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibico,美國(guó))

表1 根據(jù)HSP70 基因設(shè)計(jì)siRNA 序列Table 1 Design siRNA sequence based on HSP70 gene

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分離和培養(yǎng)小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞

取妊娠期18.5 d 的孕鼠麻醉消毒,剖腹取胎鼠(觀察B6-Co 胎鼠的眼瞼部開(kāi)閉,眼瞼開(kāi)啟則為EOB 表型小鼠,眼瞼關(guān)閉則舍棄,B6 孕鼠腹中胎鼠則全部可用)的眼瞼組織剪碎,胰酶消化,100 目、40目網(wǎng)篩梯度過(guò)濾,離心,完全培養(yǎng)基重懸,放于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h 后換新鮮完全培養(yǎng)基。 細(xì)胞按照1 ∶3傳代,傳代3 次以上待用。

1.3.2 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞的觀察

將細(xì)胞傳代培養(yǎng)到第3 代時(shí),將細(xì)胞接種于圓玻片上,進(jìn)行細(xì)胞爬片；待細(xì)胞密度約80%,棄去培養(yǎng)基,PBS 洗滌,70%乙醇固定過(guò)夜,PBS 輕洗細(xì)胞；蘇木素染色20 min,自來(lái)水清洗。 伊紅染色2 s,自來(lái)水清洗。 乙醇梯度脫水透明,滴加中性樹(shù)膠蓋玻片,拍照。

1.3.3 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞的鑒定

將細(xì)胞傳代培養(yǎng)到第3 代時(shí),將細(xì)胞接種于圓玻片上,進(jìn)行細(xì)胞爬片；待細(xì)胞密度約80%,棄去培養(yǎng)基,PBS 洗滌細(xì)胞,進(jìn)行固定、通透、封閉等常規(guī)細(xì)胞免疫熒光染色步驟,在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.4 檢測(cè)小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,每孔種2×104個(gè)細(xì)胞。 將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔取均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 和7 d 后直接血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.5 兩種成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70 mRNA 含量檢測(cè)

從18.5 d 的孕鼠體內(nèi)獲取B6-Co 和B6 胎鼠,從其眼瞼部位取材培養(yǎng)成纖維細(xì)胞待其傳代3 次之后種六孔板,重復(fù)3 次。 通過(guò)常規(guī)方法提取RNA、逆轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR(目的基因以內(nèi)參基因的GAPDH進(jìn)行校正,每個(gè)樣本3 次重復(fù)。 根據(jù)HSP70 基因mRNA 設(shè)計(jì)RT-PCR 反應(yīng)引物:GAPDH:Primer-F:5’-GGAGCGAGACCCCACTAAC-3 ’； Primer-R: 5 ’-GGCGGAGATGATGACCCT-3’. HSP70:Primer-F:5’-CCAAGGTGCAGGTGAAC TACAAGG-3’； Primer-R:5’-GCCGCTGAGAGTCGTTGAAGTAG-3’.)使用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)眼瞼成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)量

在兩種細(xì)胞培養(yǎng)至第3 代后,接種細(xì)胞,收集3次樣本,提取兩種細(xì)胞的全蛋白、電泳(80 V,120 V)、轉(zhuǎn)膜(300 mA,90 min),室溫封閉2 h。 一抗4℃孵育過(guò)夜(1/1000),PBST 洗3 × 10 min。 二抗室溫孵育2 h(1/1000),PBS 洗3 × 20 min,顯影。

1.3.7 siRNA-HSP70 的設(shè)計(jì)與合成

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢小鼠HSP70 基因序列(Accession Number:NM_010478.2),最終設(shè)計(jì)3 條siRNA 序列、1 條NC 序列進(jìn)行合成,見(jiàn)表1。 siRNAHSP70 的合成委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3.8 siRNA-HSP70 轉(zhuǎn)染B6 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞

B6 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞種于12 孔板中,待密度達(dá)到50%～60%時(shí),取2 μL siRNA-HSP70 溶于100 μL Opti-MEM 基 培 中, 再 取 2 μL Lipofectamin2000 溶于100 μL Opti-MEM 基培中,混勻后,室溫各孵育5 min；再將兩者混勻,室溫孵育20 min；成纖維細(xì)胞換液,更換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液800 μL；混合液加入12 孔板中,混勻,細(xì)胞37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h 后更換成完全培養(yǎng)液。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h 提取總RNA、72 h 提取總蛋白。

1.3.9 Transwell 檢測(cè)眼瞼成纖維細(xì)胞遷移能力的變化

本實(shí)驗(yàn)選用直徑6.5 mm, 孔徑8 μm 的Transwell 小室；0.25%胰酶將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞消化,以DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升5×105個(gè)細(xì)胞；加100 μL 細(xì)胞懸液至Transwell 上室,加入500 μL DMEM 培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)至Transwell 下室,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出Transwell 小室,吸盡培養(yǎng)基,PBS 清洗3 次；放入4%多聚甲醛中固定20 min；棄固定液,PBS 搖床洗10 min；放入結(jié)晶紫中室溫染色10 min；PBS 輕洗2 次,每次5 min；用脫脂棉擦去小室上表面細(xì)胞,顯微鏡下取5 個(gè)視野拍照計(jì)數(shù),以備后續(xù)統(tǒng)計(jì)、分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用STATA V16.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。 數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,獲得數(shù)據(jù)分析為正態(tài)性分布,采用配對(duì)t檢驗(yàn),當(dāng)P＜0.05 視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成纖維細(xì)胞形態(tài)

使用倒置相差顯微鏡觀察從B6 和B6-Co 小鼠眼瞼取出的成纖維細(xì)胞,在400 倍鏡下可以看出兩種成纖維細(xì)胞都呈現(xiàn)梭形、星型、多角型。 但是B6小鼠的成纖維細(xì)胞更為舒展,且胞體較大；而B(niǎo)6-Co小鼠的眼瞼成纖維細(xì)胞在400 倍鏡下發(fā)現(xiàn)其邊緣較為粗糙,形態(tài)與B6 相比更為狹小,見(jiàn)圖1。

2.2 通過(guò)免疫熒光法鑒定B6 和B6-Co 小鼠成纖維細(xì)胞

使用免疫熒光技術(shù)鑒定原代取材的細(xì)胞,根據(jù)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn):使用眼瞼部位皮膚進(jìn)行原代取材一般存在兩種細(xì)胞:成纖維細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞。 因此使用Vimentin (波形蛋白)和Cytokeratin (細(xì)胞角蛋白)進(jìn)行免疫熒光染色(圖2、圖3),因?yàn)椴ㄐ蔚鞍资浅衫w維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白,而細(xì)胞角蛋白是角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。 所以從圖2、圖3 中發(fā)現(xiàn),在B6 與B6-Co 兩種成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)里,發(fā)現(xiàn)被染色的波形蛋白,而沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞角蛋白,說(shuō)明成纖維細(xì)胞純度達(dá)到100%。 因此,可以證明原代取材B6 和B6-Co 小鼠眼瞼部位成纖維細(xì)胞成功。

2.3 通過(guò)HE 染色觀察B6 和B6-Co 小鼠成纖維細(xì)胞

HE 染色方法主要是用蘇木素染核呈藍(lán)色,而伊紅染色主要是染細(xì)胞胞漿。 從圖4 可以發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,胞漿為紅色,細(xì)胞核被染成藍(lán)色,符合成纖維細(xì)胞特征。 B6 和B6-Co 小鼠成纖維細(xì)胞在HE 染色上沒(méi)有顯著性差別。

2.4 通過(guò)血球計(jì)數(shù)板法檢測(cè)B6 和B6-Co 小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)

通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法,原代取材培養(yǎng)三代以后,胰酶消化后離心棄上清,重懸沉淀,人工計(jì)數(shù),種板——每孔約2×104個(gè)。 之后7 d 定時(shí)通過(guò)數(shù)值統(tǒng)計(jì),得出圖5 的兩種細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 可以發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞都呈現(xiàn)增殖趨勢(shì),但在第7 天略微下降,細(xì)胞長(zhǎng)滿進(jìn)入平臺(tái)期。 而B(niǎo)6 小鼠成纖維細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)每天都略高于B6-Co 小鼠成纖維細(xì)胞數(shù)量,B6 小鼠成纖維細(xì)胞第1 天后即進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,B6-Co 則在第2 天進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,因此由圖5 可以判定,B6-Co 小鼠成纖維細(xì)胞增殖速度顯著低于B6 正常成纖維細(xì)胞增殖速度(P＜0.01)。

2.5 通過(guò)Real-time PCR 法檢測(cè)B6-Co 和B6 小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70 mRNA 的表達(dá)

通過(guò)常規(guī)方法提取RNA 進(jìn)行Real-time PCR 實(shí)驗(yàn),從圖中發(fā)現(xiàn),B6-Co 小鼠眼瞼部位成纖維細(xì)胞HSP70 mRNA 表達(dá)量低于B6 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞,且二者具有顯著性差異(圖6)。

2.6 通過(guò)Western blot 檢測(cè)B6-Co 和B6 小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70 蛋白表達(dá)量

通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),B6-Co 小鼠眼瞼部位成纖維細(xì)胞的HSP70 蛋白表達(dá)量低于B6 小鼠成纖維細(xì)胞,且二者具有顯著性差異(圖7)。

2.7 siRNA-HSP70 對(duì)HSP70 基因的干擾效率

在轉(zhuǎn)染48 h 后,通過(guò)Real-time PCR 驗(yàn)證HSP70 基因mRNA 水平的干擾效率；在轉(zhuǎn)染72 h后,通過(guò)Western blot 驗(yàn)證HSP70 基因蛋白水平的干擾效率。 結(jié)果表明(圖8):各組均能對(duì)靶基因的mRNA 及蛋白表達(dá)產(chǎn)生抑制作用,siRNA-HSP70-3組較其他組抑制作用最強(qiáng),B6 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞HSP70 基因的表達(dá)量下降最為顯著,干擾效率高達(dá)70%以上(P＜0.01),以上結(jié)果表明siRNA-HSP70-3 能夠有效靶向抑制HSP70 基因的表達(dá),保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的有效開(kāi)展。

注:A:波形蛋白；D:細(xì)胞角蛋白；B、E:DAPI 染色；C、F:合成圖。圖2 免疫熒光鑒定B6 小鼠的眼瞼成纖維細(xì)胞Note. A, Vimentin. D, Cytokeratin. B/E, DAPI staining. C/F, Merge.Figure 2 Immunofluorescence identification of orbital fibroblasts from B6 mice

注:A:波形蛋白；D:細(xì)胞角蛋白；B、E:DAPI 染色；C、F:合成圖。圖3 免疫熒光鑒定B6-Co 小鼠的眼瞼成纖維細(xì)胞Note. A, Vimentin. D, Cytokeratin. B/E, DAPI staining. C/F, Merge.Figure 3 Immunofluorescence identification of orbital fibroblasts from B6-Co mice

注:A/B/C:B6 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞；D/E/F:B6-Co 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞。圖4 HE 染色鑒定B6 與B6-Co 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞Note. A/B/C, B6 mouse orbital fibroblasts. D/E/F, B6-Co mouse orbital fibroblasts.Figure 4 HE staining of B6 and B6-Co mouse orbital fibroblasts

注:血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)B6 和B6-Co 小鼠成纖維細(xì)胞個(gè)數(shù),與B6 組相比,**P ＜0.01。圖5 B6 和B6-Co 小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Note. The number of fibroblasts in B6 and B6-Co mice was counted by blood cell counting plate. Compared with the B6 group, **P ＜0.01.Figure 5 Growth curve of fibroblasts in B6 and B6-Co mice

注:Real-time PCR 檢測(cè)B6-Co 和B6 小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70 mRNA 表達(dá)量。 與B6 組相比,**P ＜0.01。圖6 B6-Co 和B6 小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70 mRNA 表達(dá)量對(duì)比Note. The expression of HSP70 mRNA in B6-Co and B6 mouse fibroblasts was detected by Real-time PCR.Compared with the B6 group, **P＜0.01.Figure 6 Comparison of HSP70 mRNA expression in fibroblasts of B6-Co and B6 mice

2.8 siRNA-HSP70 對(duì)B6 成纖維細(xì)胞遷移能力的影響

通過(guò)Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSP70 基因下調(diào)后成纖維細(xì)胞的體外遷移能力,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖9)可知,siRNA -HSP70 組的成纖維細(xì)胞,在Transwell 小室接種培養(yǎng)24 h 后,其穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量極顯著低于siRNA -NC 組(P＜0.01),這表明敲低HSP70 基因能夠顯著降低B6 成纖維細(xì)胞的體外遷移能力。

3 討論

先天性角膜混濁(congenital corneal opacities,CCO)是一種較為罕見(jiàn)的遺傳性疾病,目前對(duì)于CCO 的診斷治療仍在不斷探索之中,而對(duì)發(fā)育障礙引發(fā)的角膜混濁一直廣受眼科學(xué)研究者關(guān)注。

發(fā)育障礙引發(fā)角膜混濁主要由遺傳因素導(dǎo)致,這與EOB 模型鼠的現(xiàn)象類似。 人類胚胎時(shí)期眼睛的發(fā)育過(guò)程一般有以下幾個(gè)過(guò)程:眼瞼生長(zhǎng)——覆蓋眼球——全部融合——重新打開(kāi)(出生后)[16]。在小鼠胚胎期眼睛發(fā)育過(guò)程中,同樣經(jīng)歷上下眼瞼生長(zhǎng)——覆蓋眼球——全部融合——重新打開(kāi)的過(guò)程[4],與人類不同的是正常小鼠出生時(shí)閉眼,至出生后12 ～14 d 才睜眼。 而EOB 表型的小鼠在出生時(shí)即睜眼,這種異?，F(xiàn)象是導(dǎo)致后代小鼠眼部患病的重要原因之一。 B6-Co 突變系小鼠出生時(shí)眼瞼即張開(kāi),使得幼年期眼部易受病原體感染[5],不能保護(hù)小鼠眼睛的正常發(fā)育,從而易患角膜炎,進(jìn)而逐步發(fā)展為角膜混濁,與人類角膜混濁的發(fā)病機(jī)制極為相似,是研究人類CCO 的良好疾病動(dòng)物模型。

注:Western blot 檢測(cè)B6-Co 和B6 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70 蛋白表達(dá)及其統(tǒng)計(jì)圖。 與B6 組相比,*P ＜0.05。圖7 B6-Co 和B6 小鼠眼瞼成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70 蛋白表達(dá)量對(duì)比Note. Western blot was used to detect the expression of HSP70 protein in B6-Co and B6 mouse eyelid fibroblasts and its statistical diagram. Compared with the B6 group, *P ＜0.05.Figure 7 Comparison of HSP70 protein expression in fibroblasts of B6-Co and B6 mice

注:A:Real-time PCR 檢測(cè)成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA-HSP70 后HSP70 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量；B:Western blot 檢測(cè)HSP70 蛋白的表達(dá)量；C:B 的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 與siRNA-NC 組相比,*P＜0.05,**P＜0.01。圖8 siRNA-HSP70 對(duì)HSP70 基因的干擾效率Note. A, Real-time PCR was used to detect the relative expression of HSP70 mRNA in fibroblasts after transfection with siRNA-HSP70. B,Western blot to detect HSP70 protein expression. C, B statistical results. Compared with the siRNA-NC group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 8 The interference efficiency of siRNA-HSP70 on HSP70 gene

注:A:siRNA-NC 組穿過(guò)Transwell 小室的成纖維細(xì)胞；B:siRNA-HSP70 組穿過(guò)Transwell 小室的成纖維細(xì)胞；C:A、B 的統(tǒng)計(jì)圖。 與siRNA-NC 組相比,*P＜0.05。圖9 siRNA-HSP70 對(duì)成纖維細(xì)胞遷移能力的影響Note. A, Fibroblasts passing through Transwell chamber in siRNA-NC group. B, Fibroblasts passing through Transwell chamber in siRNAHSP70 group. C, Statistical charts for A and B. Compared with the siRNA-NC group, *P ＜0.05.Figure 9 Effect of siRNA-HSP70 on migration ability of fibroblasts

HSP70 蛋白是熱休克蛋白家族中被研究較多的一種蛋白,大多數(shù)研究者關(guān)注在HSP70 家族的結(jié)構(gòu)、功能以及表達(dá)調(diào)控機(jī)理方面的研究[11-14]。 在前期實(shí)驗(yàn)中通過(guò)比較兩種小鼠角膜組織蛋白分析發(fā)現(xiàn)突變系B6-Co 小鼠中HSP70 基因的表達(dá)量顯著下調(diào)[8],所以B6-Co 小鼠體內(nèi)HSP70 表達(dá)量的進(jìn)一步降低可能影響了眼瞼成纖維細(xì)胞增殖遷移[16]能力,導(dǎo)致其胚胎期上下緣眼瞼無(wú)法正常生長(zhǎng)融合,導(dǎo)致該小鼠出生時(shí)的EOB 表型。 有研究表明,HSP70 在細(xì)胞內(nèi)的含量可能與胚胎發(fā)育中保護(hù)與被保護(hù)有關(guān)[21],細(xì)胞內(nèi)HSP70 的表達(dá)量的高低可能影響成纖維細(xì)胞在胚胎期發(fā)育[22-27]。 眼瞼邊緣部位細(xì)胞遷移障礙是引發(fā)B6-Co 出現(xiàn)EOB 表型的重要原因,因而成纖維細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)弱是小鼠出生前眼瞼愈合重要因素。 而實(shí)驗(yàn)(圖9)通過(guò)小干擾實(shí)驗(yàn)敲低B6 小鼠成纖維細(xì)胞HSP70 的表達(dá),使用Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞的遷移能力被顯著性降低(P＜0.05)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,B6 和B6-Co 小鼠胚胎期眼瞼成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70 的mRNA 表達(dá)量和蛋白表達(dá)量存在顯著差異,與兩種小鼠角膜組織蛋白二維凝膠電泳的結(jié)果一致。 說(shuō)明HSP70 基因及蛋白表達(dá)下調(diào)影響了B6-Co 的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,同時(shí)下調(diào)HSP70 表達(dá)降低了成B6 纖維細(xì)胞遷移能力。 因此HSP70 基因可能參與成纖維細(xì)胞胚胎期發(fā)育的調(diào)控,最終造成B6-Co 小鼠EOB 表型。 HSP70 基因如何調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡? 其他相關(guān)基因又是如何影響成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育? 眼瞼、眼附屬器以及眼角膜等胚胎發(fā)育過(guò)程中的協(xié)調(diào)機(jī)制又是如何實(shí)現(xiàn)的? 這一系列問(wèn)題均有待于持續(xù)深入研究才能闡明,而B(niǎo)6-Co 小鼠將來(lái)能否作為眼病研究的動(dòng)物模型還需進(jìn)一步探討。