酵母β-葡聚糖水解酶的表達(dá)及應(yīng)用

周 星， 王 麗， 堵國成，2， 康 振*，2

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2. 江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

酵母β-葡聚糖是存在于酵母細(xì)胞壁中的一種多糖，占細(xì)胞壁干質(zhì)量的40%～60%[1]。 酵母β-葡聚糖是以β-1，3-葡聚糖為主，β-1，6-葡聚糖為輔的一種混合多糖，其中85%左右為水不溶性。 研究表明， 酵母β-葡聚糖是一種良好的生物效應(yīng)應(yīng)答劑，具有增強(qiáng)免疫力、激活免疫細(xì)胞、抗腫瘤、抗感染等功能[2]。此外，酵母β-葡聚糖還可以抗氧化、抗輻射、降低膽固醇和血脂。 因此，酵母β-葡聚糖已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健食品和化妝品行業(yè)中[3-5]。

酵母β-葡聚糖通過分子間氫鍵的相互作用，形成致密的三股螺旋結(jié)構(gòu)而不溶于水，水不溶性不僅制約了酵母β-葡聚糖的應(yīng)用范圍，也會影響其生物活性的發(fā)揮[6]。為了提高酵母β-葡聚糖的水溶性，國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了修飾和改性研究，主要方法有化學(xué)方法、物理方法和生物方法。 物理方法主要有超聲波法[7]、輻照法[8]和機(jī)械活化法[9]；化學(xué)方法有羧甲基化[10]、硫酸酯化[11]和磷酸酯化[12]；生物方法主要是酶法。酶法増溶改性是通過β-葡聚糖酶將大分子酵母β-葡聚糖酶解成小分子葡聚糖，從而增加酵母β-葡聚糖的水溶性，水解過程條件溫和，不會破壞酵母β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)，對其生物活性影響較小。 目前， 用于生物法對酵母葡聚糖改性增溶的酶種類少，價格昂貴[13]。 本研究中，作者在大腸桿菌中異源表達(dá)兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶， 分別是β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m[14]和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312[15]。 Gly5m 來源于Saccharophagus degradans 2-40T ， 對于β-1，3-葡聚糖具有內(nèi)切水解作用。BT3312 來源于Bacteroides thetaiotaomicron， 對β-1，6-葡聚糖具有內(nèi)切水解作用。 通過兩種不同的酵母β-葡聚糖的水解作用， 可以降低酵母β-葡聚糖的相對分子質(zhì)量，增加其在水中的溶解率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 E. coli （大腸桿菌） JM109：用于構(gòu)建和增殖重組質(zhì)粒，作者所在實驗室保存；E. coli（大腸桿菌）BL21：表達(dá)宿主，作者所在實驗室保存；質(zhì)粒pET-28a（+）（Kan+，T7 啟動子）：作者所在實驗室保存。

1.1.2 酶、引物、DNA marke 及相關(guān)試劑盒 Primer STAR DNA 聚合酶、 DNA marker、T4 DNA 連接酶和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備盒：均購自TaKaRa（大連）；各種限制性內(nèi)切酶：購自Thermo 公司；PCR 引物：由生工生物（上海）有限公司合成，見表1；質(zhì)粒小量抽提試劑盒：購自生工生物（上海） 有限公司；酵母葡聚糖：購自安琪酵母公司。

表1 PCR 擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5；自然pH。 制備固體培養(yǎng)基時添加2 g/dL 的瓊脂。

TB 培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨12，酵母提取物24，KH2PO42.31，K2HPO412.54；甘油4 mL。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得

1）gly5m 的 獲 得： 根 據(jù)GenBank 噬 菌 體 的gly5m 基因（基因收錄號：ABD82280.1）由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成。

2）bt3312 的獲得：根據(jù)GenBank 多形擬桿菌的bt3312 基因（基因收錄號：AE015928.1）由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行全基因合成。

1.2.2 重組載體的構(gòu)建

1）pET-28a（+）-gly5m 的構(gòu)建：設(shè)計引物F1 和R1，以合成的gly5m 為模板PCR 擴(kuò)增得到上游帶有BamH I 酶切位點和下游帶有Xho I 酶切位點的gly5m 產(chǎn)物。用BamH I 和Xho I 對PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a（+）進(jìn)行酶切后，用T4 DNA 連接酶進(jìn)行過夜連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM109 感受態(tài)，挑取轉(zhuǎn)化子測序，測序正確即獲得重組質(zhì)粒pET-28a（+）-gly5m，見圖1。

2）pET-28a（+）-bt3312 的構(gòu)建：設(shè)計引物F2 和R2， 以合成的bt3312 為模板PCR 擴(kuò)增得到上游帶有BamH I 酶切位點和下游帶有Xho I 酶切位點的bt3312 產(chǎn)物。 用BamH I 和Xho I 對PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a（+）進(jìn)行酶切后，用T4 DNA 連接酶進(jìn)行過夜連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子測序，測序正確即獲得重組質(zhì)粒pET-28a（+）-bt3312，見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒p ET-28a（+）-gly5m 和pET28a（+）-bt3312構(gòu)建過程圖Fig. 1 Schematic of plasid construction pET-28a（+）-gly5m and pET28a（+）-bt3312

1.2.3 重組載體的轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)表達(dá) 挑取測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），挑取單菌落接種于裝有3 mL LB 液體培養(yǎng)基 （含有50 μg/mL氨芐青霉素或卡那霉素）的12 mL 搖菌管中，37 ℃、220 r/min 過夜培養(yǎng)。 種子液按2%接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接至含50 mL TB （含有50 μg/mL 氨芐青霉素或卡那霉素）的250 mL 三角瓶中，37 ℃、220 r/min 培養(yǎng)至OD600＝0.6～0.8，添加終濃度為0.2 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)12 h，收集菌體。

1.2.4 重組β-葡聚糖水解酶的酶活測定 發(fā)酵液于7 000 r/min 離心10 min，分離得到上清液即胞外粗酶液。 收集菌體，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水洗滌，20 mmol/L PBS 緩沖液（pH 7.5）重懸菌體，稀釋至合適的濃度，超聲破碎。13 000 r/min 離心30 min，分離得到破碎上清液， 即胞內(nèi)粗酶液。 底物配制：20 mmol/L PBS 緩沖液 （pH 7.5），10 mg/mL 的酵母葡聚糖。990 μL 底物加10 μL 適當(dāng)稀釋的粗酶液于37 ℃水浴保溫30 min，DNS 法測還原糖質(zhì)量濃度。

1.2.5 重組β-葡聚糖水解酶水解產(chǎn)物HPLC 分析水解條件：20 mmol/L PBS 緩沖液（pH 7.5），酵母葡聚糖4 g/L，酶活10 U/mL。 設(shè)置3 個實驗組：第一組只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二組只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312； 第三組同時添加等酶活的β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m 和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。 37 ℃下反應(yīng)12 h，取樣分析。 水解樣品使用孔徑0.22 μL 的濾膜過濾后， 采用高效體積排阻色譜和多角度激光散射聯(lián)用進(jìn)行相對分子質(zhì)量測定。 采用UltrahydrogelTM色譜柱（300 mm×7.8 mm，美國沃特斯公司）、多角度激光散射檢測器（美國懷雅特公司）檢測和示差折光檢測器（美國懷雅特公司）檢測。 條件：0.1 mol/L NaNO3溶液作為流動相，流速恒定保持在0.6 mL/min，柱溫保持在40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.6 重組β-葡聚糖水解酶產(chǎn)物溶解率測定 水解條件：20 mmol/L PBS 緩沖液（pH 7.5），酵母葡聚糖25 g/L，酶活200 U/mL。 設(shè)置3 個實驗組：第一組只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二組只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312； 第三組同時添加等酶活的β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m 和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。 37 ℃反應(yīng)12 h，定時取樣。 樣品于12 000 r/min 離心10 min， 用蒽酮法測定上清液中的總糖質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增和重組載體的構(gòu)建

2.1.1 pET-28a （+）-gly5m 的 構(gòu) 建 以 合 成 的gly5m 為模板，引物F1 和R1 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大約2 700 bp 的片段，見圖2（a）。

采用DNA 純化回收試劑盒對單一凝膠片段進(jìn)行回收，回收后的gly5m 片段與用BamH I 和Xho I酶切后得到的線性質(zhì)粒pET-28a （+）-gly5m 連接，轉(zhuǎn)化 E. coli JM109， 挑取轉(zhuǎn)化子交由上海生工生物工程有限公司測序， 測序結(jié)果正確， 重組載體pET-28a（+）-gly5m 構(gòu)建成功。

2.1.2 pET-28a （+）-bt3312 的構(gòu)建 以合成的bt3312 為模板，引物F2 和R2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增得到大約1 600 bp 的片段，見圖2（b）。采用DNA 純化回收試劑盒對單一凝膠片段進(jìn)行回收，回收后的bt3312 片段與用BamH I 和Xho I 酶切后得到的線性質(zhì)粒pET-28a （+）-bt3312 連接， 轉(zhuǎn)化E. coli JM109， 挑取轉(zhuǎn)化子交由上海生工生物工程有限公司測序， 測序結(jié)果正確， 重組載體pET-28a （+）-bt3312 構(gòu)建成功。

圖2 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 2 Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis

2.2 誘導(dǎo)溫度對重組β-葡聚糖水解酶的影響

2.2.1 誘導(dǎo)溫度對Gly5m 的影響 將重組菌E. coli BL21（DE3）-pET-28a（+）-gly5m 分 別 在20、25、30 ℃下誘導(dǎo)12 h，離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖3（a）。 重組菌分別在20、25、30 ℃下誘導(dǎo)12 h 后，所得重組β-葡聚糖水解酶Gly5m 總酶活分別為605、707、559 U/mL。結(jié)果表明，溫度對重組β-葡聚糖水解酶Gly5m 的酶活影響較小。 另外， 重組菌在30 ℃誘導(dǎo)12 h 后，Gly5m 都分泌到胞外， 細(xì)胞破碎上清液無酶活；在20、25 ℃誘導(dǎo)12 h 后，細(xì)胞破碎上清液中還存在少量重組β-葡聚糖水解酶。

2.2.2 誘導(dǎo)溫度對BT3312 的影響 將重組菌E.coli BL21（DE3）-pET-28a（+）-gly5m 分別 在20、25、30 ℃下誘導(dǎo)12 h 后，離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖3（b）。 重組菌在30、25、20 ℃下誘導(dǎo)12 h 后，所得重組β-葡聚糖水解酶BT3312 總酶活分別為1 652、1 896、1 888 U/mL，25 ℃誘導(dǎo)時酶活最高。 另外，重組菌在20 ℃誘導(dǎo)時，BT3312 胞內(nèi)酶活最高。結(jié)果表明，溫度不僅影響B(tài)T3312 的酶活，同時也會影響B(tài)T3312 向胞外分泌。

圖3 不同誘導(dǎo)溫度對Gly5m 和BT3312 酶活的影響Fig. 3 Effects of different induction temperatures on the enzyme activity of Gly5m and BT3312

2.3 誘導(dǎo)時間對重組β-葡聚糖水解酶的影響

2.3.1 誘導(dǎo)時間對Gly5m 的影響 由2.2.1 可知，重組菌E. coli BL21（DE3）- pET-28a（+）-gly5m 在25 ℃誘導(dǎo)時酶活最高， 故將重組菌在25 ℃分別誘導(dǎo)4、6、8、10 h。 離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖4（a）。 重組菌在25 ℃誘導(dǎo)4 h 后，重組β-葡聚糖水解酶Gly5m 總酶活達(dá)到最高，為1 086 U/mL，且此時胞外酶活也達(dá)到最高，為888 U/mL。 此外，重組菌在誘導(dǎo)時間超過4 h后，總酶活開始下降，說明Gly5m 不穩(wěn)定，開始降解。

2.3.2 誘導(dǎo)時間對BT3312 的影響 由2.2.2 可知，重組菌E. coli BL21（DE3）- pET-28a（+）-bt3312 在25 ℃誘導(dǎo)時酶活最高， 故將重組菌在25 ℃分別誘導(dǎo)4、6、8、10 h。 離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖4（b）。 重組菌在30 ℃誘導(dǎo)8 h 后，總酶活達(dá)到最高，為2 355 U/mL，且此時胞內(nèi)、胞外酶活均達(dá)到最高，分別為917、1 438 U/mL。 此外，重組菌在誘導(dǎo)時間超過8 h 后，酶活開始下降，說明BT3312 也不穩(wěn)定。

圖4 不同誘導(dǎo)時間對Gly5m 和BT3312 酶活的影響Fig. 4 Effects of different induction time on the enzyme activity of Gly5m and BT3312

2.4 重組β-葡聚糖水解酶的水解產(chǎn)物HPLC 分析

以未經(jīng)重組β-葡聚糖水解酶水解的酵母葡聚糖為對照，對3 個實驗組水解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC 分析，結(jié)果見圖5。 兩種重組酶都有水解酵母葡聚糖的能力，且兩種重組酶可以同時添加共同發(fā)揮作用。 比較3 種水解方式所得產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BT3312 水解后，所得產(chǎn)物相對分子質(zhì)量最大， 推測原因可能是BT3312 專一性水解β-1，6-糖苷鍵，而在酵母β-葡聚糖中，β-1，6-葡聚糖少，占10%～15%[16]，因此通過BT3312 水解后， 所得產(chǎn)物中大部分的β-葡聚糖沒有水解，故相對分子質(zhì)量大。 反之，Gly5m 主要水解β-1，3-糖苷鍵，在酵母β-葡聚糖中，β-1，3-葡聚糖多，故經(jīng)Gly5m 水解后，所得產(chǎn)物相對分子質(zhì)量更小。 此外，當(dāng)BT3312 和Gly5m 共同水解時，水解最徹底，剩余的底物最少，推測原因是酵母β-葡聚糖中同時含有β-1，3-糖苷鍵和β-1，6-糖苷鍵，而β-1，6-糖苷鍵的存在可能會影響β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m 發(fā)揮作用， 故當(dāng)β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312 水解掉β-1，6-糖苷鍵后，Gly5m 才能更好地發(fā)揮水解作用，使水解更加徹底。

圖5 Gly5m 和BT3312 水解酵母β-葡聚糖的產(chǎn)物分析Fig. 5 Analysis of yeast β-glucan hydrolyzed by Gly5m and BT3312

2.5 重組β-葡聚糖水解酶水解產(chǎn)物的溶解率

酵母β-葡聚糖經(jīng)過Gly5m 和BT3312 單獨或共同水解后，溶解率均有增加，結(jié)果見圖6。 添加相同酶量水解時，同時添加Gly5m 和BT3312，水解產(chǎn)物溶解率增加量最多，從12%增加到50%，水溶性酵母葡聚糖質(zhì)量濃度為12.5 g/L。 當(dāng)Gly5m 和BT3312 共同水解時，酵母葡聚糖水解最徹底，前后結(jié)果一致。 當(dāng)只用Gly5m 水解時，酵母葡聚糖溶解率提高了2.6 倍， 水溶性酵母葡聚糖質(zhì)量濃度為11 g/L；當(dāng)只用BT3312 水解時，酵母葡聚糖溶解率提高了2.4 倍， 水溶性酵母葡聚糖質(zhì)量濃度為10.25 g/L。

3 結(jié) 語

酵母β-葡聚糖廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健食品和化妝品行業(yè)中，但因為其水不溶性，限制了它的應(yīng)用。作者在E. coli 中表達(dá)了兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶， 兩種酶不僅都有水解酵母β-葡聚糖的能力， 而且可以同時發(fā)揮作用。 通過兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶的水解作用，使得酵母β-葡聚糖溶解性增加，且結(jié)構(gòu)和活性不被破壞。 但是，兩種水解酶在E. coli 中表達(dá)量低，SDS-PAGE 檢測分析中沒有明顯條帶，為進(jìn)一步提高表達(dá)量和酶活，可通過優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、構(gòu)建不同啟動子的表達(dá)系統(tǒng)等進(jìn)行嘗試表達(dá)。 此外，作者對兩種酵母β-葡聚糖水解酶共同水解酵母葡聚糖以提高其水溶性只進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步提高水解效率，可以優(yōu)化水解條件、添加的酶活濃度以及兩種水解酶的比例。

圖6 Gly5m 和BT3312 水解酵母β-葡聚糖產(chǎn)物溶解率Fig. 6 Water-solubility of yeast β-glucan hydrolyzed by Gly5m and BT3312