黃芪多糖抑制缺氧/復(fù)氧損傷乳鼠心肌細(xì)胞凋亡與自噬機(jī)制研究

沈玉玨

(邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056000)

冠心病的患病人群逐年增加，其引發(fā)的心肌梗死成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。中藥黃芪味甘、性溫，具有補(bǔ)氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效。黃芪多糖(Astraglus polysaccharides，APS)為黃芪的主要活性成分，由葡萄糖、果糖、己糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等組成，具有抗氧化、抗凋亡、提高免疫力等多種藥理學(xué)作用[1-2]。目前，APS在臨床上主要用于白細(xì)胞減少、免疫功能低下的腫瘤患者的輔助治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，APS對缺血性腎損傷后細(xì)胞凋亡和成肌細(xì)胞損傷后細(xì)胞自噬均具有抑制作用[3-4]。

及早恢復(fù)缺血區(qū)心肌血流灌注是改善心肌梗死預(yù)后的關(guān)鍵，而細(xì)胞凋亡與自噬是心肌梗死后細(xì)胞死亡的重要病理機(jī)制[5-6]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)APS能夠通過抑制氧化應(yīng)激保護(hù)缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷乳鼠心肌細(xì)胞[7]，但APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞凋亡與自噬的影響尚未見文獻(xiàn)報道。本研究旨在探究APS對H/R所致心肌細(xì)胞凋亡與自噬的影響并初探其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠乳鼠(出生時間<24 h)，購自河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2018-004]。

1.2 藥物與試劑 APS(西安沃森生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國GIBCO公司)；CCK-8試劑盒、BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)、P62、β-actin抗體(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 主要儀器 ZHJH-C1115B型超凈工作臺(上海智成分析儀器制造有限公司)；Labofuge 400R型低溫離心機(jī)(德國Thermo Electron公司)；RAcell 150型CO2培養(yǎng)箱(德國Beraeus公司)；RT-6100型酶標(biāo)儀(美國Rayto公司)；1659001型電泳儀、1703940型轉(zhuǎn)膜儀、Chem Doc XRS型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 乳鼠心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)[8]報道，無菌環(huán)境取乳鼠左心室組織經(jīng)胰酶消化處理后過200目篩，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，壁立1 h后收集未貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105個/ml，接種于 35 mm培養(yǎng)皿，置37 ℃、5% CO2、100%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 乳鼠心肌細(xì)胞分組、給藥與H/R損傷細(xì)胞模型制備：取對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整濃度為6×105個/ml，設(shè)置正常組、H/R組和APS低、中、高劑量組，每組10皿；造模前30 min，APS低、中、高劑量分別滴加終濃度20、40、80 μmol/ml的APS溶液進(jìn)行干預(yù)，正常組和H/R組不做處理。模型制備：參照文獻(xiàn)[9]報道的方法，H/R組和APS低、中、高劑量組更換無糖DMEM培養(yǎng)基，置缺氧盒中，缺氧盒通入流速為1 L/min的95% N2和5% CO2混合氣15 min后置細(xì)胞培養(yǎng)箱2.5 h為缺氧過程，然后從缺氧盒中取出并更換含糖DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2、100%濕度培養(yǎng)箱，即復(fù)氧，2 h檢測各指標(biāo)。

1.4.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測：各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度6×105個/ml的單細(xì)胞懸液，以100 μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組10個復(fù)孔，以10 μl/孔加入濃度10%的CCK-8溶液，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，胰酶消化并離心收集細(xì)胞，然后通過酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度值(A)，增殖抑制率(%)=(1-A藥物組/A正常組)×100%。

1.4.4 細(xì)胞凋亡水平檢測：取各組離心收集的細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明，滴加稀釋后的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，滴加Annexin V-FITC和PI染液，37 ℃避光孵育15 min后，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

1.4.5 細(xì)胞蛋白水平檢測：取各組離心收集的細(xì)胞，滴加RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min后，4 ℃、12000 r/min離心30 min，取上清液，檢測蛋白濃度后行高溫變性，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉處理后滴加目標(biāo)蛋白和β-actin抗體4 ℃孵育過夜，然后二抗37 ℃孵育1 h后滴加DAB顯色，通過條帶灰度值計算蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞增殖的影響 見表1。H/R組細(xì)胞增殖抑制率較正常組顯著升高(P<0.01)；APS中、高劑量組增殖抑制率較H/R組顯著降低(P<0.01)。

2.2 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 見表1。H/R組細(xì)胞凋亡率較正常組顯著升高(P<0.01)；APS低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率較H/R組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表1 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響(%)

2.3 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量的影響 見表2(圖1)。H/R組p-Akt、p-mTOR相對表達(dá)量較正常組顯著降低(P<0.01)；APS低、中、高劑量組p-Akt、p-mTOR相對表達(dá)量較H/R組顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

A：正常組；B：H/R組；C：APS低劑量組；D：APS中劑量組；E：APS高劑量組圖1 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達(dá)的影響

表2 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量的影響

2.4 APS對H/R損傷相對乳鼠心肌細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量的影響 見表3(圖2)。H/R組細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白相對表達(dá)量較正常組顯著升高，而Bcl-2相對表達(dá)量較正常組顯著降低(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值較正常組顯著降低(P<0.01)；與H/R組比較，APS中、高劑量組Cleaved Caspase-3、Bax相對表達(dá)量降低且Bcl-2表達(dá)量升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.01)。

A：正常組；B：H/R組；C：APS低劑量組；D：APS中劑量組；E：APS高劑量組圖2 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

表3 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達(dá)量和Bcl-2/Bax比值的影響

2.5 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞Beclin1、LC3、P62蛋白相對表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影響 見表4(圖3)。H/R組細(xì)胞Beclin1、LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)、P62蛋白相對表達(dá)量較正常組顯著升高(P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值較正常組顯著升高(P<0.01)；APS中、高劑量組Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bax相對表達(dá)量較H/R組顯著降低，且Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05或P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值較H/R組顯著降低(P<0.01)。

A：正常組；B：H/R組；C：APS低劑量組；D：APS中劑量組；E：APS高劑量組圖3 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞Beclin1、LC3、P62蛋白表達(dá)的影響

表4 APS對H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞Beclin1、LC3、P62蛋白相對表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影響

3 討 論

通過藥物溶栓或介入手術(shù)及時恢復(fù)血流灌注是臨床搶救心肌梗死患者的關(guān)鍵。但實現(xiàn)血流再灌注后將引發(fā)活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)大量釋放并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡與自噬，從而嚴(yán)重影響心肌梗死治療預(yù)后[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APS干預(yù)能夠有效降低H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率，提示APS對H/R致心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用。

Bcl-2家族(Bcl-2、Bax)和Caspase-3蛋白參與細(xì)胞凋亡過程調(diào)節(jié)，其中Bcl-2蛋白具有其通透性的生理學(xué)作用；缺氧復(fù)氧能夠病理性刺激Bax移位線粒體膜，導(dǎo)致其通透性升高而過度釋放細(xì)胞色素C(Cyt C)[13-15]。Bax與Bcl-2結(jié)合成二聚體而致使二者失去生理活性，因此計算Bax/Bcl-2比值對闡明二者在細(xì)胞凋亡中所起的作用具有一定意義[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，APS能夠下調(diào)Cleaved Caspase-3、Bax表達(dá)并上調(diào)Bcl-2表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值，這可能是APS抑制H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

LC3表達(dá)于自噬體膜，有LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ兩種亞型，LC3-Ⅱ通過線粒體途徑具有促細(xì)胞自噬作用[17]。Beclin1通過轉(zhuǎn)運自噬蛋白而間接發(fā)揮促細(xì)胞自噬作用[18]。P62能夠誘導(dǎo)靶蛋白泛素化，進(jìn)而被自噬體包裹而降解，并且能夠與非泛素化蛋白聚集體結(jié)合而誘導(dǎo)其被自噬清除[19]。本研究提示APS具有抑制H/R損傷乳鼠心肌細(xì)胞自噬的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達(dá)有關(guān)。

Akt是一種存在于機(jī)體各細(xì)胞中原癌基因，p-Akt能夠磷酸化Cleaved Caspase-3使其失去生理活性，并可抑制Bax蛋白表達(dá)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，APS能夠上調(diào)p-Akt、p-mTOR表達(dá)，激活A(yù)kt/mTOR通路。

綜上所述，APS能夠通過激活A(yù)kt/mTOR通路調(diào)控凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，對H/R所致乳鼠心肌細(xì)胞凋亡與自噬起到抑制作用。