黃芪多糖抑制缺氧/復(fù)氧損傷乳鼠心肌細胞凋亡與自噬機制研究

沈玉玨

(邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056000)

冠心病的患病人群逐年增加，其引發(fā)的心肌梗死成為威脅人類生命健康的主要疾病之一。中藥黃芪味甘、性溫，具有補氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效。黃芪多糖(Astraglus polysaccharides，APS)為黃芪的主要活性成分，由葡萄糖、果糖、己糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等組成，具有抗氧化、抗凋亡、提高免疫力等多種藥理學(xué)作用[1-2]。目前，APS在臨床上主要用于白細胞減少、免疫功能低下的腫瘤患者的輔助治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，APS對缺血性腎損傷后細胞凋亡和成肌細胞損傷后細胞自噬均具有抑制作用[3-4]。

及早恢復(fù)缺血區(qū)心肌血流灌注是改善心肌梗死預(yù)后的關(guān)鍵，而細胞凋亡與自噬是心肌梗死后細胞死亡的重要病理機制[5-6]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)APS能夠通過抑制氧化應(yīng)激保護缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷乳鼠心肌細胞[7]，但APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞凋亡與自噬的影響尚未見文獻報道。本研究旨在探究APS對H/R所致心肌細胞凋亡與自噬的影響并初探其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠乳鼠(出生時間<24 h)，購自河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2018-004]。

1.2 藥物與試劑 APS(西安沃森生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國GIBCO公司)；CCK-8試劑盒、BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)、P62、β-actin抗體(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 主要儀器 ZHJH-C1115B型超凈工作臺(上海智成分析儀器制造有限公司)；Labofuge 400R型低溫離心機(德國Thermo Electron公司)；RAcell 150型CO2培養(yǎng)箱(德國Beraeus公司)；RT-6100型酶標儀(美國Rayto公司)；1659001型電泳儀、1703940型轉(zhuǎn)膜儀、Chem Doc XRS型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 乳鼠心肌細胞分離與培養(yǎng)：參照文獻[8]報道，無菌環(huán)境取乳鼠左心室組織經(jīng)胰酶消化處理后過200目篩，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備單細胞懸液，壁立1 h后收集未貼壁細胞，調(diào)整細胞濃度為6×105個/ml，接種于 35 mm培養(yǎng)皿，置37 ℃、5% CO2、100%濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 乳鼠心肌細胞分組、給藥與H/R損傷細胞模型制備：取對數(shù)生長期細胞調(diào)整濃度為6×105個/ml，設(shè)置正常組、H/R組和APS低、中、高劑量組，每組10皿；造模前30 min，APS低、中、高劑量分別滴加終濃度20、40、80 μmol/ml的APS溶液進行干預(yù)，正常組和H/R組不做處理。模型制備：參照文獻[9]報道的方法，H/R組和APS低、中、高劑量組更換無糖DMEM培養(yǎng)基，置缺氧盒中，缺氧盒通入流速為1 L/min的95% N2和5% CO2混合氣15 min后置細胞培養(yǎng)箱2.5 h為缺氧過程，然后從缺氧盒中取出并更換含糖DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2、100%濕度培養(yǎng)箱，即復(fù)氧，2 h檢測各指標。

1.4.3 細胞增殖抑制率檢測：各組細胞經(jīng)胰酶消化和重懸后制備濃度6×105個/ml的單細胞懸液，以100 μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組10個復(fù)孔，以10 μl/孔加入濃度10%的CCK-8溶液，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，胰酶消化并離心收集細胞，然后通過酶標儀檢測570 nm處吸光度值(A)，增殖抑制率(%)=(1-A藥物組/A正常組)×100%。

1.4.4 細胞凋亡水平檢測：取各組離心收集的細胞，按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明，滴加稀釋后的結(jié)合緩沖液重懸細胞，滴加Annexin V-FITC和PI染液，37 ℃避光孵育15 min后，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.4.5 細胞蛋白水平檢測：取各組離心收集的細胞，滴加RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min后，4 ℃、12000 r/min離心30 min，取上清液，檢測蛋白濃度后行高溫變性，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉處理后滴加目標蛋白和β-actin抗體4 ℃孵育過夜，然后二抗37 ℃孵育1 h后滴加DAB顯色，通過條帶灰度值計算蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞增殖的影響 見表1。H/R組細胞增殖抑制率較正常組顯著升高(P<0.01)；APS中、高劑量組增殖抑制率較H/R組顯著降低(P<0.01)。

2.2 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞凋亡的影響 見表1。H/R組細胞凋亡率較正常組顯著升高(P<0.01)；APS低、中、高劑量組細胞凋亡率較H/R組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表1 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞增殖和凋亡的影響(%)

2.3 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量的影響 見表2(圖1)。H/R組p-Akt、p-mTOR相對表達量較正常組顯著降低(P<0.01)；APS低、中、高劑量組p-Akt、p-mTOR相對表達量較H/R組顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

A：正常組；B：H/R組；C：APS低劑量組；D：APS中劑量組；E：APS高劑量組圖1 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達的影響

表2 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達量的影響

2.4 APS對H/R損傷相對乳鼠心肌細胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量的影響 見表3(圖2)。H/R組細胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白相對表達量較正常組顯著升高，而Bcl-2相對表達量較正常組顯著降低(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值較正常組顯著降低(P<0.01)；與H/R組比較，APS中、高劑量組Cleaved Caspase-3、Bax相對表達量降低且Bcl-2表達量升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.01)。

A：正常組；B：H/R組；C：APS低劑量組；D：APS中劑量組；E：APS高劑量組圖2 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

表3 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量和Bcl-2/Bax比值的影響

2.5 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞Beclin1、LC3、P62蛋白相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影響 見表4(圖3)。H/R組細胞Beclin1、LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)、P62蛋白相對表達量較正常組顯著升高(P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值較正常組顯著升高(P<0.01)；APS中、高劑量組Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bax相對表達量較H/R組顯著降低，且Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05或P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值較H/R組顯著降低(P<0.01)。

A：正常組；B：H/R組；C：APS低劑量組；D：APS中劑量組；E：APS高劑量組圖3 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞Beclin1、LC3、P62蛋白表達的影響

表4 APS對H/R損傷乳鼠心肌細胞Beclin1、LC3、P62蛋白相對表達量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影響

3 討 論

通過藥物溶栓或介入手術(shù)及時恢復(fù)血流灌注是臨床搶救心肌梗死患者的關(guān)鍵。但實現(xiàn)血流再灌注后將引發(fā)活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)大量釋放并誘導(dǎo)心肌細胞凋亡與自噬，從而嚴重影響心肌梗死治療預(yù)后[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)APS干預(yù)能夠有效降低H/R損傷乳鼠心肌細胞增殖抑制率和凋亡率，提示APS對H/R致心肌細胞凋亡具有抑制作用。

Bcl-2家族(Bcl-2、Bax)和Caspase-3蛋白參與細胞凋亡過程調(diào)節(jié)，其中Bcl-2蛋白具有其通透性的生理學(xué)作用；缺氧復(fù)氧能夠病理性刺激Bax移位線粒體膜，導(dǎo)致其通透性升高而過度釋放細胞色素C(Cyt C)[13-15]。Bax與Bcl-2結(jié)合成二聚體而致使二者失去生理活性，因此計算Bax/Bcl-2比值對闡明二者在細胞凋亡中所起的作用具有一定意義[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，APS能夠下調(diào)Cleaved Caspase-3、Bax表達并上調(diào)Bcl-2表達，提高Bcl-2/Bax比值，這可能是APS抑制H/R損傷乳鼠心肌細胞凋亡的分子機制。

LC3表達于自噬體膜，有LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ兩種亞型，LC3-Ⅱ通過線粒體途徑具有促細胞自噬作用[17]。Beclin1通過轉(zhuǎn)運自噬蛋白而間接發(fā)揮促細胞自噬作用[18]。P62能夠誘導(dǎo)靶蛋白泛素化，進而被自噬體包裹而降解，并且能夠與非泛素化蛋白聚集體結(jié)合而誘導(dǎo)其被自噬清除[19]。本研究提示APS具有抑制H/R損傷乳鼠心肌細胞自噬的作用，其機制可能與下調(diào)Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達有關(guān)。

Akt是一種存在于機體各細胞中原癌基因，p-Akt能夠磷酸化Cleaved Caspase-3使其失去生理活性，并可抑制Bax蛋白表達[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，APS能夠上調(diào)p-Akt、p-mTOR表達，激活A(yù)kt/mTOR通路。

綜上所述，APS能夠通過激活A(yù)kt/mTOR通路調(diào)控凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達，對H/R所致乳鼠心肌細胞凋亡與自噬起到抑制作用。