枇杷葉膠囊的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

（惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)系，廣東 惠州 516025）

枇杷葉為薔薇科植物枇杷的干燥葉，別名巴葉、蘆橘葉，全年均可采收[1]。《中藥大辭典》記載道：枇杷葉具有清肺和胃、降氣化痰功能，是治療肺熱咳喘的要藥[2]。因其獨(dú)特的藥用價(jià)值，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也非常普遍。枇杷葉中的化學(xué)成分多樣，目前從中分離出來的成分主要有三萜酸類、黃酮類、揮發(fā)油、有機(jī)酸類、多酚類、皂苷類等[3]。目前藥理研究表明其主要有效成分集中在三萜酸類化合物[4]，具有良好的鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘等作用[5]，三萜酸中以熊果酸和齊墩果酸的含量最高[6]，可作為枇杷葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[7]。百姓素有使用枇杷葉水煎液的習(xí)慣，但其存在著不易保存、不便攜帶等不足之處。中藥膠囊劑具有質(zhì)量穩(wěn)定、易存儲(chǔ)、使用和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。課題組前期已以熊果酸和齊墩果酸為指標(biāo)，對(duì)枇杷葉進(jìn)行了提取工藝的優(yōu)選[8]，本研究以流動(dòng)性、吸濕性、成型性[9]、輔料用量為考察指標(biāo)，確定枇杷葉膠囊的最佳制備工藝，并初步建立簡(jiǎn)單可行的枇杷葉膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化研發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JA3003電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；BPG-9240A鼓風(fēng)干燥箱（上海百典儀器設(shè)備有限公司）；BJ-3崩解時(shí)限測(cè)試儀（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；PS-40A超聲波清潔機(jī)（深圳市科潔超聲科技有限公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Thermo ODS-2 Hypersil色譜柱（賽默飛世爾科技公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（鄭州博科儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑與試藥

淀粉，糖粉，微晶纖維素，可溶性淀粉（山東聊城華陽(yáng)醫(yī)藥輔料有限公司）；乳糖，醋酸銨（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；甲苯，丙酮（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；硫酸，無(wú)水乙醇（分析純，臺(tái)山市粵僑試劑塑料有限公司）；乙腈，甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水（蒸餾水，屈臣氏飲用水有限公司）；熊果酸對(duì)照品，齊墩果酸對(duì)照品（北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司）；枇杷葉對(duì)照藥材（上海一研生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 輔料的選擇

因枇杷葉濃縮液真空干燥后成塊狀黏連固體，不利于進(jìn)一步制劑，故選擇濕法制粒后，再填充膠囊。

2.1.1 單一輔料的考察 取5份枇杷葉稠膏，各5 g，分別加入一定量的淀粉、可溶性淀粉、乳糖、糖粉、微晶纖維素，混合制粒，以輔料用量、休止角、吸濕率、成型狀態(tài)為指標(biāo)，考察結(jié)果見表1。由表1可見，淀粉的流動(dòng)性最好，乳糖的吸濕性最好。但乳糖和糖粉用量大，會(huì)增大藥品的服用量，故排除乳糖和糖粉；可溶性淀粉不易混合均勻；淀粉用量稍大，顆粒細(xì)粉多，但價(jià)格低廉；微晶纖維素用量少，顆粒細(xì)粉多，價(jià)格較高。綜合以上因素，不宜使用單一輔料進(jìn)行制劑，需進(jìn)一步對(duì)配伍輔料進(jìn)行考察。

表1 單一輔料考察結(jié)果

2.1.2 配伍輔料的考察 取5份枇杷葉稠膏，各5 g，加入不同比例的微晶纖維素和淀粉進(jìn)行制粒，以輔料用量、休止角、吸濕率、成型狀態(tài)為指標(biāo)，考察結(jié)果見表2。由表2可見，各配比輔料制得的顆粒流動(dòng)性均符合制劑要求，各比例的吸濕性差別不大，結(jié)合考慮輔料用量和成型性兩因素，確定選用微晶纖維素與淀粉配比為1:1作為輔料制粒，稠膏與輔料的比例約為1:1。

表2 配伍輔料考察結(jié)果

2.2 膠囊殼的選擇

2.2.1 堆密度測(cè)定 取顆粒3份，各約4 g，精密稱定，填充于10 ml量筒中，由5 cm高度處落在木板上，反復(fù)振動(dòng)3次后，測(cè)定顆粒的體積（V），根據(jù)公式ρ=m/V計(jì)算堆密度，測(cè)得堆密度分別為0.409，0.411，0.407 g/ml，均值為0.409 g/ml。

2.2.2 膠囊殼的裝量 按2015年版《中國(guó)藥典》[10]，枇杷葉藥材的使用量為6～10 g，藥材中熊果酸和齊墩果酸總含量不低于0.70 %折算，設(shè)計(jì)以每粒膠囊應(yīng)含熊果酸和齊墩果酸不得少于5 mg，每人每天服用3次，每次3粒計(jì)算，通過預(yù)測(cè)試顆粒的含量，推測(cè)出每粒膠囊約裝0.2 g。結(jié)合堆密度的測(cè)定結(jié)果，根據(jù)膠囊殼型號(hào)和近似容積的關(guān)系，選擇1號(hào)空心膠囊（近似容積為0.5 ml）分裝。

2.3 枇杷葉膠囊制備

取枇杷葉690 g，采用80 %乙醇提取，液料比為12:1，回流提取2次，每次1 h[8]。80 ℃減壓濃縮，得稠膏約138 g，相對(duì)密度約為1.24，加入輔料[微晶纖維素-淀粉（1:1）]140 g，制粒，干燥，裝入膠囊，制成1000粒，即得。

2.4 膠囊劑的檢查

根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)膠囊劑的要求，對(duì)膠囊劑作外觀、水分、裝量差異、崩解時(shí)限檢查[11]。

2.4.1 外觀與性狀 膠囊外觀整潔，無(wú)黏結(jié)、變形及破裂現(xiàn)象，無(wú)異味；內(nèi)容物為黃褐色顆粒，味微苦，顆粒干燥，松緊適度，色澤一致。

2.4.2 水分 取3批枇杷葉膠囊內(nèi)容物各2份，每份約2 g，按《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)規(guī)定[11]進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示均符合要求，見表3。

2.4.3 裝量差異的檢查 從3批枇杷葉膠囊中隨機(jī)抽取10粒，按《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)規(guī)定[11]進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示均符合要求，見表3。

2.4.4 崩解時(shí)限的檢查 取3批枇杷葉膠囊，每批6粒，按《中國(guó)藥典》2015年版相關(guān)規(guī)定[11]進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示均符合要求，見表3。

表3 3批枇杷葉膠囊檢查結(jié)果

2.5 定性鑒別

2.5.1 供試品溶液制備 取3批枇杷葉膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，各取1 g，分別加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，即得。

2.5.2 對(duì)照藥材溶液制備 取枇杷葉對(duì)照藥材1 g，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，即得。

2.5.3 對(duì)照品溶液制備 取熊果酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml含熊果酸1 mg的溶液，即得。

2.5.4 陰性供試品溶液制備 按處方取輔料1 g，準(zhǔn)確稱定，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，即得。

2.5.5 薄層色譜（TLC）鑒別 吸取3批供試品溶液、對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（5:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見圖1。由圖1可見，供試品、對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜在相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性供試品基本無(wú)干擾。

圖1 枇杷葉膠囊TLC鑒別

2.6 含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.5 %醋酸銨溶液（73:12:15）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 ml/min；理論塔板數(shù)按熊果酸峰計(jì)算應(yīng)不低于5000[8]。

2.6.2 對(duì)照品溶液制備

2.6.2.1 熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 取熊果酸對(duì)照品適量，加乙醇，制成每1 ml含熊果酸3.080 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.6.2.2 齊墩果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 取果齊墩酸對(duì)照品適量，加乙醇，制成每1 ml含齊墩果酸1.160 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.6.2.3 混合對(duì)照品溶液制備 分別取熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液、齊墩果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于10 ml量瓶中，以乙醇定容，得到含熊果酸1.540 mg/ml、齊墩果酸0.580 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.6.3 供試品溶液制備 取枇杷葉膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，用乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6.4 空白溶液制備 按處方取輔料1 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加入乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，用乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6.5 專屬性考察 取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液及空白溶液各10 μl，分別注入液相色譜儀，按2.6.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見圖2。由圖2可見，齊墩果酸和熊果酸出峰時(shí)間適宜，峰形良好，空白溶液無(wú)干擾。

圖2 專屬性考察HPLC圖譜

2.6.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液和齊墩果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.625，1.25，2.5，5，10 ml，置20 ml量瓶中，以乙醇定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液，取系列混合對(duì)照品溶液各10 μl，按2.6.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。以系列混合對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，進(jìn)行回歸計(jì)算，得熊果酸回歸方程y=3048.3x+0.9007（r=0.9999），在濃度為0.096～1.540 mg/ml時(shí)線性關(guān)系良好；齊墩果酸回歸方程y=4754.9x-17.269（r=0.9998），在濃度為0.036～0.580 mg/ml時(shí)線性關(guān)系良好。

2.6.7 精密度考察 取供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.6.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，熊果酸和齊墩果酸峰面積RSD值均為0.40 %，表明儀器精密度良好。

2.6.8 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，室溫下放置，分別于0，6，12，30，48，72 h進(jìn)樣10 μl，測(cè)得熊果酸和齊墩果酸的色譜峰面積RSD值分別為2.35 %，2.34 %，表明供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.9 重復(fù)性考察 取供試品溶液 6份，各10 μl，按2.6.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。測(cè)得熊果酸和齊墩果酸兩者總含量RSD為2.61 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.10 加樣回收率考察 取已知含量的枇杷葉膠囊內(nèi)容物9份，研細(xì)，稱取0.1 g，精密稱定，置10 ml量瓶中，分為3組，每組分別加入齊墩果酸對(duì)照品溶液0.4，0.6，1.2 ml和熊果酸0.8，1.0，1.2 ml，加入乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，用乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液各10 μl，注入液相色譜儀，按2.6.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定齊墩果酸峰面積積分值，計(jì)算回收率和RSD值。結(jié)果見表4、表5。

表4 齊墩果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 熊果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6.11 樣品中熊果酸和齊墩果酸含量的測(cè)定 取3批樣品，按2.6.2和2.6.3項(xiàng)下方法分別配制對(duì)照品和供試品溶液，每批平行測(cè)定3份，測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 樣品中熊果酸和齊墩果酸含量

3 討論

本文通過輔料用量、吸濕性、流動(dòng)性、成型性對(duì)制劑的輔料進(jìn)行篩選，最終確定選用微晶纖維素、淀粉，兩者配比為1:1；通過堆密度實(shí)驗(yàn)，并依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》中枇杷葉的使用量進(jìn)行折算，選定1號(hào)空心膠囊進(jìn)行填充。

因枇杷葉膠囊是枇杷葉的單方制劑，故首選2015年版《中國(guó)藥典》枇杷葉藥材項(xiàng)下的方法對(duì)枇杷葉膠囊進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰，分離效果好。多次試驗(yàn)結(jié)果表明方法重現(xiàn)性好。

熊果酸和齊墩果酸是枇杷葉中含量最高的三萜酸類成分，而三萜酸是枇杷葉抗炎止咳的主要成分，因此選定熊果酸和齊墩果酸為枇杷葉膠囊的定量指標(biāo)。采用HPLC法建立了枇杷葉膠囊中熊果酸和齊墩果的含量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，考察結(jié)果表明該方法專屬性好、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好、回收率良好。本方法可有效地控制枇杷葉膠囊的質(zhì)量。

通過上述枇杷葉膠囊的一般檢查（外觀性狀、水分、崩解時(shí)限、裝量差異）結(jié)果、TLC鑒別方法的確定、含量測(cè)定方法的建立及3批樣的含量驗(yàn)證，為枇杷葉膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定提供了數(shù)據(jù)支持，同時(shí)為枇杷葉膠囊的質(zhì)量可控提供了保證。