穿山龍多糖的提取及其體外抗氧化活性研究

朱夢堯，旁赟寧，譚景全，呂 沖，陳祥娥

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院，山東 日照 276826）

穿山龍，薯蕷科，又名黃姜，大部分分布于海拔較高的地方，生長溫度以15～25 ℃最佳[1]。穿山龍具有活血舒筋、止咳平喘、消食利水、止痛等功效；民間多用于浸酒或煎服，可用于慢性支氣管炎、筋骨疼痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿山龍具有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管、祛痰、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，應(yīng)用前景十分廣闊[2-7]。目前對穿山龍藥用成分的研究以皂苷為主，對多糖研究較少[8-10]。中藥多糖類成分具有顯著的降血糖、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用，是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一[11-14]。為加強(qiáng)穿山龍藥材的綜合應(yīng)用，本試驗(yàn)采用水提醇沉法提取穿山龍多糖，考察料液比、水浴溫度和提取時(shí)間的影響，并進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。對所得穿山龍多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行考察，為穿山龍多糖的標(biāo)準(zhǔn)化提取和藥材的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

752N紫外可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；TDL-60B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH-1數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；BS110型電子天平（德國賽多利斯）；X3R離心機(jī)（美國賽默飛世爾）；DHG-9030A干燥器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 樣品與試劑

穿山龍藥材由中藥學(xué)教研室提供并鑒定；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Sigma），葡萄糖對照品，無水乙醇，抗壞血酸（Vc），濃硫酸，苯酚，氫氧化鈉，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，鄰苯三酚，三氯化鐵，鐵氰化鉀等均為分析純。

2 方法

2.1 穿山龍多糖提取工藝

取干燥的穿山龍根莖，粉碎過80目篩。取一定量的藥粉按相應(yīng)的提取條件浸漬提取2次，合并提取液，濃縮后醇沉，所得沉淀復(fù)溶后經(jīng)進(jìn)一步純化干燥獲得干浸膏。分別研究料液比、水浴溫度及提取時(shí)間等因素水平變化對所得多糖的影響，以此為依據(jù)進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.2 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。取葡萄糖對照品10 mg，溶解后加蒸餾水定容于100 ml量瓶中，得葡萄糖對照品溶液。選取8只試管，分別加入0.1～0.8 ml葡萄糖對照品溶液，加水稀釋到1.0 ml。分別加入6 %苯酚溶液0.5 ml及濃硫酸2.5 ml，混勻后靜置20 min。另取一只試管作為對照，加入蒸餾水1.0 ml和上述相應(yīng)體積的苯酚、濃硫酸，490 nm處測定吸光度（A490）值，以A490為縱坐標(biāo)（y），以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/ml），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 穿山龍多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 料液比的影響 分別稱取20 g穿山龍藥粉，固定提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為3 h，考察料液比分別為1:6，1:10，1:14，1:18條件下，所得穿山龍多糖的含量。

2.3.2 水浴溫度的影響 分別稱取20 g穿山龍藥粉，固定料液比為1:10，提取時(shí)間為3 h，考察提取溫度分別為60，70，80，90 ℃條件下，所得穿山龍多糖的含量。

2.3.3 提取時(shí)間的影響 分別稱取20 g穿山龍藥粉，固定料液比為1:10，提取溫度為90 ℃，考察提取時(shí)間分別為2，3，4，5 h條件下，所得穿山龍多糖的含量。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，對料液比、水浴溫度、提取時(shí)間進(jìn)行三因素兩水平的實(shí)驗(yàn)并分析，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)及水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)參數(shù)及水平

2.5 穿山龍多糖體外抗氧化性研究[15]

其中，ΔAx為樣品的自氧化速率；ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率。

2.5.2 總還原能力實(shí)驗(yàn) 將所得穿山龍多糖加水配制成濃度分別為0.1，0.5，1，2，5，10，15 mg/ml的樣品溶液。分別取0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.6）和1 %鐵氰化鉀溶液各2.5 ml，混勻后分別加入不同濃度的樣品溶液各1 ml，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷卻，并依次加入蒸餾水2.0 ml，0.1 % FeCl32.0 ml，混勻，室溫靜置10 min后，測定700 nm處吸光度（A700），以Vc為陽性對照[9]，每組平行測定3次。

2.5.3 DPPH?清除能力實(shí)驗(yàn) 將所得穿山龍多糖加水配制成濃度分別為0.1，0.5，1，2，5，10，15 mg/ml的樣品溶液。取5 ml樣品溶液，置于試管中，分別加入0.2 mmol/L DPPH?乙醇溶液1 ml，混勻，室溫下避光放置30 min，以乙醇溶液為空白對照，測定517 nm處吸光度（A517），Vc為陽性對照，每組平行測定3次。

DPPH?自由基清除率（%）=[1-（Ax-Ac）/A0]×100 %

其中：Ax為樣品吸光度；A0為空白組吸光度；Ac為樣品本底吸光度。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

按2.2項(xiàng)所述硫酸-苯酚法，得葡萄糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.012x-0.007，R2=0.992。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知葡萄糖濃度與A490之間線性關(guān)系良好，可用于多糖含量的測定。

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 料液比對穿山龍多糖提取率的影響 料液比對穿山龍多糖提取率的影響見圖1。由圖1可見，隨著料液比的增加，多糖提取率呈上升趨勢，當(dāng)料液比高于1:10后，提取率增加不明顯，估計(jì)此時(shí)組織中多糖溶出已近飽和，為節(jié)約成本，確定適宜料液比為1:10。

圖1 料液比對穿山龍多糖提取率的影響

3.2.2 水浴溫度對穿山龍多糖提取率的影響 水浴溫度對穿山龍多糖提取率的影響見圖2。由圖2可見，隨著溫度的增加，多糖提取率明顯上升，當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃左右，提取率仍有增加趨勢，變動(dòng)不大，因此將提取適宜溫度選定為90 ℃。

圖2 水浴溫度對穿山龍多糖提取率的影響

3.2.3 提取時(shí)間對穿山龍多糖提取率的影響 提取時(shí)間對穿山龍多糖提取率的影響見圖3。由圖3可見，隨著時(shí)間的延長，多糖提取率基本呈上升趨勢，考慮提取效率和效果，提取時(shí)間以4 h左右為好。

圖3 提取時(shí)間對穿山龍多糖提取率的影響

3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素兩水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見表2。由表2可見，對穿山龍多糖提取率影響最大的因素為提取時(shí)間，其次是水浴溫度，影響較小的是料液比。綜合以上分析結(jié)果，并考慮實(shí)際生產(chǎn)過程中的需要，確定最佳提取工藝為：料液比1:10，水浴溫度90 ℃，提取時(shí)間4 h。此條件下所得粗多糖提取率為2.72 %。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.4 穿山龍多糖的抗氧化活性

圖4 穿山龍多糖（A）與Vc（B）的清除能力

3.4.2 總還原能力測定 總還原能力試驗(yàn)中，抗氧化劑可作為電子供體將鐵氰化鉀的Fe3+還原成Fe2+，形成亞鐵氰化鉀，后者進(jìn)一步與FeCl3反應(yīng)，生成在700 nm下有強(qiáng)吸收的普魯士藍(lán)，抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)，A700越高。穿山龍多糖總還原能力結(jié)果見圖5，結(jié)果表明隨著多糖濃度逐漸升高，A700上升，當(dāng)濃度大于3 mg/ml后，吸光度趨于平穩(wěn)（約0.249±0.001）。實(shí)驗(yàn)測得Vc濃度在0.1～0.5 mmol/L范圍內(nèi)與A700線性關(guān)系良好，所得穿山龍多糖的總還原力最大值約相當(dāng)于（0.338±0.006）mmol/L Vc的還原力。

圖5 穿山龍多糖（A）與Vc（B）總還原能力

3.4.3 DPPH?清除能力 DPPH?為一種性質(zhì)較為穩(wěn)定的自由基，抗氧化性物質(zhì)能提供電子，滅活DPPH?同時(shí)削弱其A517。穿山龍多糖DPPH?清除能力見圖6，隨著多糖濃縮的升高DPPH?清除率逐漸上升。當(dāng)濃度大于5 mg/ml時(shí)，清除率趨于平穩(wěn)，最大值為85.63 %±0.43 %（15 mg/ml）。在0.12～0.60 mmol/L范圍內(nèi)Vc的DPPH?清除率與濃度呈線性關(guān)系，所得穿山龍多糖的DPPH?清除能力最大值約相當(dāng)于（0.520±0.015）mmol/L Vc的清除能力。

圖6 穿山龍多糖（A）與Vc（B）對DPPH?清除能力

4 小結(jié)與討論

穿山龍具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗突變等作用[16]。本實(shí)驗(yàn)考察了穿山龍多糖水醇法提取工藝的關(guān)鍵因素，并進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定關(guān)鍵因素中，對多糖提取率影響最大的是提取時(shí)間，其次為水浴溫度，而料液比的影響較小。確定最佳工藝為料液比1:10，水浴溫度90 ℃，提取時(shí)間4 h，多糖提取率為2.72 %。所得多糖經(jīng)進(jìn)一步純化后進(jìn)行了體外抗氧化性研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穿山龍多糖對及DPPH?均表現(xiàn)出良好的清除能力，對Fe3+也具有較好的還原力，具有開發(fā)為抗氧化劑的潛能，其抗氧化作用具有一定的劑量依賴性。本實(shí)驗(yàn)為穿山龍多糖的標(biāo)準(zhǔn)化提取和藥材的綜合開發(fā)利用提供了一定的研究基礎(chǔ)和參考。