結(jié)球甘藍(lán)α-法呢烯合成酶基因的鑒定與功能分析

張彤，汪一萍，葛洋，NTIRI Eric，周文武,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所，閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室，福州350002；2.浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點實驗室，杭州310058）

植物依賴次生代謝物來應(yīng)對環(huán)境脅迫，并進化出復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)來調(diào)節(jié)這些化合物的合成。植物的次生代謝系統(tǒng)能產(chǎn)生眾多的揮發(fā)性化合物，其中的植物揮發(fā)性有機物（volatile organic compounds,VOCs）在植物對植食者的防御中扮演著重要的角色，也是昆蟲識別植物的化學(xué)指紋[1]。據(jù)現(xiàn)有的研究統(tǒng)計，植物體內(nèi)的揮發(fā)物達(dá)3萬多種，且它們的分子質(zhì)量通常較小，在100～200 Da之間[2-3]，這些揮發(fā)物根據(jù)其性質(zhì)分為普遍存在的揮發(fā)物和特異性的揮發(fā)物[4]。特異性的揮發(fā)物是植物受植食性昆蟲取食或侵害后，其體內(nèi)被激發(fā)產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)[5-6]，通常稱之為蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物（herbivoreinduced plant volatiles,HIPVs）。這類揮發(fā)物作為信號因子，在“植物-植物”以及“農(nóng)作物-害蟲-天敵”之間的化學(xué)通信中行使重要的功能[7-8]。比如，棉花產(chǎn)生的揮發(fā)物硝基苯酚[（E）-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene, DMNT]能抑制海灰翅夜蛾（Spodoptera littoralis）對棉花的取食，并影響成蟲的交配行為，從而導(dǎo)致下一代種群個體數(shù)顯著降低[9]。薰衣草產(chǎn)生的揮發(fā)物氧化芳樟醇會對草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）雄蛾產(chǎn)生顯著的驅(qū)避效果[10]。大花六道木（Abelia grandiflora）釋放的β-蒎烯和苯乙醛可引誘 稻 褐 飛 虱（Nilaparvate lugens）、白 背 飛 虱（Sogatella furcifera）、灰飛虱（Laodelphax striatellus）等水稻害蟲的寄生蜂——稻虱纓小蜂（Anagrus nilaparvatae）[11]。玉米植株受揮發(fā)物（Z）-3-乙酸己烯酯[（Z）-3-hexenyl acetate, HAC]影響可激活玉米植株內(nèi)的蟲害防御基因的表達(dá)，而HAC和吲哚2種揮發(fā)物的混用能增強茉莉酸信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御基因的表達(dá)和次生防御代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而增強玉米的抗蟲性[12]。

植物萜類合成酶（terpene synthase,TPS）基因是植物合成其萜類化合物的關(guān)鍵酶。根據(jù)TPS 的功能差異可以將其分為倍半萜合成酶、單萜合成酶和二萜合成酶等。萜類合成途徑可分為甲羥戊酸（mevalonic acid,MVA）途徑和丙酮酸（pyruvic acid,MEP）途徑，該2種途徑都可以合成萜類的前體物質(zhì)異戊烯焦基磷酸（isopentene coke phosphoric acid,IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylpropylpyrophosphate,DMAPP）。在法呢基焦磷酸酶或異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的催化下，IPP和DMAPP分別生成法呢烯基焦磷酸（farnesenyl pyrophosphate,FPP）或牻牛兒基焦磷酸（geranyl pyrophosphate,GPP）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP）。FPP、GPP和GGPP在萜類合成酶的作用下生成異戊二烯單體分子以及由這個單體經(jīng)復(fù)合反應(yīng)產(chǎn)生的有機物，比如半萜（C5）、單萜（C10）、倍半萜（C15）以及二萜（C20）等。

隨著植物基因組測序技術(shù)的發(fā)展，植物TPS 家族規(guī)模不斷擴大。根據(jù)現(xiàn)有的研究統(tǒng)計，植物中各類萜烯合成酶基因總數(shù)從30～100 個不等[13]，特別是葡萄、蘋果、毛果楊和大豆等植物的基因組測序促成了對它們萜類合成酶家族基因的解析和功能分析[14]。基于萜類合成酶的重要功能，一些研究者在農(nóng)作物中圍繞TPS基因開展了深入研究。這些工作從沉默萜類合成的關(guān)鍵基因出發(fā)，通過抑制特定萜類在植株內(nèi)的合成和釋放，解析萜類揮發(fā)物功能。如通過沉默水稻石竹烯合成酶基因OsTPS3的表達(dá)，水稻釋放的石竹烯吸引稻飛虱及其天敵稻虱纓小蜂的機制得到了揭示[15-16]。此外，在黃豆中過表達(dá)GmAFS基因后，轉(zhuǎn)基因黃豆的須根中釋放的大量α-法呢烯增強了黃豆對根結(jié)線蟲的抗性[17]。目前，在擬南芥、煙草和番茄等植物中圍繞萜類合成酶也已有眾多研究[13]，但是，有關(guān)結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea）的萜類合成酶尚未有深度的研究和報道。結(jié)球甘藍(lán)的全基因組測序為其萜類合成酶基因的鑒定和功能研究提供了可能[18]，也為深入解析一些重要萜類揮發(fā)物在其體內(nèi)的合成機制及功能提供了條件。

結(jié)球甘藍(lán)是全球范圍內(nèi)廣泛栽培的一種十字花科蕓薹屬蔬菜，具有重要的經(jīng)濟價值。自20世紀(jì)90 年代以來，全球蕓薹屬作物種植面積急速擴大，并以集約化耕作為主，而該屬蔬菜在生產(chǎn)中面臨病蟲害爆發(fā)的威脅[17]。小菜蛾（Plutella xylostella）是取食十字花科植物的重要寡食性昆蟲[19]，前期研究發(fā)現(xiàn)，α-法呢烯在甘藍(lán)受小菜蛾幼蟲取食后釋放，對小菜蛾成蟲具有一定的驅(qū)避作用；觸角電位（electroantennogram,EAG）研究也證實了α-法呢烯能被小菜蛾成蟲識別[20]，說明該化合物在小菜蛾和結(jié)球甘藍(lán)的互作中可能扮演著重要的角色。為解析α-法呢烯在結(jié)球甘藍(lán)體內(nèi)合成的機制，本研究克隆了其合成途徑的關(guān)鍵酶α-法呢烯合成酶基因（BoTPSa），闡明了蟲害和非生物脅迫因子對其表達(dá)的影響，并對α-法呢烯合成酶進行了原核表達(dá)和生化功能測定，證實其在萜類合成途徑中的作用，并研究了該蛋白在植物體內(nèi)的亞細(xì)胞定位情況。本研究首次系統(tǒng)解析了結(jié)球甘藍(lán)的α-法呢烯合成酶的功能，為后續(xù)探索該蛋白及其產(chǎn)物的生態(tài)功能提供了基礎(chǔ)，也為其他十字花科作物的萜類的合成和功能研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用河北邢壯牌結(jié)球甘藍(lán)種子‘京豐一號’（河北省邢臺華豐種子有限公司），在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，處理周期為14 h光照/10 h黑暗，溫度23 ℃，待其生長30 d后，選取長勢相近的健康植株進行試驗。

小菜蛾在福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所繁育，幼蟲采用白菜幼苗室內(nèi)喂養(yǎng)，小菜蛾成蟲以5%蜂蜜水飼養(yǎng)。小菜蛾世代培育溫度設(shè)置為24～26 ℃，相對濕度設(shè)置為45%～70%，光照周期為17 h光照/7 h黑暗。

1.2 BoTPSa 基因的克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建

利用“α-farnesene synthase”“Brassica oleracea”等關(guān)鍵詞對結(jié)球甘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行搜索，對搜索到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/）中的BLASTX 里再次確認(rèn)序列的準(zhǔn)確性。設(shè)計2條可以擴增完整開放閱讀框的特異性引物來擴增目的基因全長序列，引物信息如下：上游引物序列為5′-GTTCATCACAATTTTGA GCTCTTT-3′；下游引物序列為5′-TGAGGAGGGA AATAAACCAATA-3′。引物由杭州尚亞生物有限公司合成。以結(jié)球甘藍(lán)為材料，RNA提取步驟參照TRIzol Reagent RNA 提取試劑盒說明書（美國Invitrogen 公司）進行，然后使用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）合成cDNA第1鏈。使用Phusion 高保真DNA 聚合酶試劑盒（美國賽默飛世爾科技有限公司）擴增獲得目的基因，將該基因命名為BoTPSa。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）產(chǎn)物用DNA 凝膠回收試劑盒（美國Vitagene公司）純化回收，利用重組Taq酶（日本TaKaRa公司）在目的片段中加上黏性末端，產(chǎn)物連入pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，由上海澤衡生物有限公司測序后保菌于－80 ℃冰箱中，備用。

1.3 萜類合成酶的生物信息學(xué)分析

采用SMART 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）對BoTPSa結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，接著利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對BoTPSa 的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測及分析。使用在線軟件Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）對BoTPSa核酸序列及其他植物的TPS基因進行多序列聯(lián)配，之后使用最大似然法在MEGA 7.0中輸入聯(lián)配的核酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 結(jié)球甘藍(lán)BoTPSa 基因的表達(dá)規(guī)律研究

分別設(shè)置蟲害處理組及對照組，逆境處理組及對照組，各組設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)。蟲害處理組：提前饑餓處理小菜蛾幼蟲，再讓其取食甘藍(lán)葉片1 h后移走。之后在停止蟲害4、8和20 h后分別對受蟲害的結(jié)球甘藍(lán)葉、莖和根進行采樣，測定各部位的BoTPSa基因表達(dá)水平。逆境處理組：1）高鹽處理組，用20 mL 200 μmol/L NaCl 溶液澆灌甘藍(lán)，每12 h 一次，澆灌2 次；2）光合作用抑制處理組，將甲基紫精溶液涂抹于葉片近葉柄處，持續(xù)24 h；3）茉莉酸甲酯誘導(dǎo)處理組，取1 mL融于羊毛脂（7.5μg/μL）的茉莉酸甲酯涂抹于近葉柄處的后半片葉上，誘導(dǎo)24 h；4）高溫處理組，將植株放在38 ℃環(huán)境下處理24 h；5）低溫處理組，將植株放在4 ℃環(huán)境下處理24 h；6）蚜蟲脅迫處理組，將5 頭蚜蟲置于甘藍(lán)葉上，持續(xù)24 h后采樣。以上樣品經(jīng)液氮研磨后提取RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，于－20 ℃條件下保存。GAPDH和EF-1為內(nèi)參基因。利用生物軟件Geneious（美國Invitrogen 公司）設(shè)計2 條定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）引物，上游引物序列為5′-TGCTCG GGAACAAATATGCG-3′，下游引物序列為5′-TGT TGCCTTAGGAGTCGGAA-3′。引物由杭州尚亞生物有限公司合成。

熒光定量PCR 使用SYBR Premix ExTaqⅡ反應(yīng)體系在CFX 96熒光定量PCR儀上進行。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。通過熔解曲線來判斷引物的特異性，基因的表達(dá)差異用2－△△CT方法進行計算。

1.5 結(jié)球甘藍(lán)BoTPSa 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

BoTPSa的密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index, CAI）＜0.8，評估表明CAI 需要進一步優(yōu)化，所以將BoTPSa基因序列與原核表達(dá)效率更高的pET-32a 載體相連，并使用密碼子優(yōu)化設(shè)計網(wǎng)站（www.genscript.com/tools/gensmart-codon-optimization）對密碼子進行優(yōu)化。輸入未優(yōu)化的BoTPSa序列信息，并選擇宿主偏好為“Escherichia coli”。待優(yōu)化結(jié)果反饋后（優(yōu)化后CAI=0.97），使用Geneious軟件（美國Invitrogen 公司）分析pET-32a 載體序列和BoTPSa基因序列特點，設(shè)計插入位點的堿基排布：1）選擇在BoTPSa序列前加入腸激酶（enterokinase,EK）酶切位點堿基序列GACGACGACGACAAG，并在EK酶切位點前加入KpnⅠ酶切位點GGTACC；2）在BoTPSa序列后加入終止密碼子TAA 以及XhoⅠ酶切位點CTCGAG。選擇自帶硫氧還蛋白A標(biāo)簽蛋白的pET-32a 作為結(jié)球甘藍(lán)的BoTPSa 原核表達(dá)載體。以KpnⅠ和XhoⅠ為雙酶切位點，利用同源重組原理，連接pET-32a和優(yōu)化后的BoTPSa基因，具體試驗步驟參照一步克隆試劑盒說明書（日本TaKaRa 公司）進行。將重組pET-32a/BoTPSa轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞后涂板，于37 ℃條件下過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進行PCR 鑒定。菌液PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序驗證正確后，重新?lián)u菌提取重組質(zhì)粒進行雙酶切并驗證條帶大小。提取構(gòu)建成功的基因表達(dá)質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)化入Rossetta（DE3）表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）檢測表達(dá)情況。

1.6 結(jié)球甘藍(lán)BoTPSa 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化及其復(fù)性

BoTPSa 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件如下：采用0.7 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-Dthiogalactoside, IPTG）進行誘導(dǎo)，分別放入16 ℃和37 ℃的搖床振蕩培養(yǎng)箱中，以220 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h。確定蛋白表達(dá)的最適溫度后，其他條件不變，分別加入不同濃度（0.1、0.4、0.7、1.0 mmol/L）的IPTG 進行誘導(dǎo)，然后使用SDS-PAGE 檢測表達(dá)情況。

收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的大量菌液，按照質(zhì)量體積比1∶10，采用勻漿機充分重懸，之后采用高壓勻漿機進行破菌，壓力700～750 Pa，溫度2～8 ℃，重復(fù)2次。破菌液于2～8 ℃條件下，以1.2×104r/min 離心30 min，收集沉淀[破菌液原料及終濃度：50 mmol/L Tris、10 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）]。包涵體沉淀和洗滌液①按照質(zhì)量體積比1∶20 在冰上攪拌洗滌2 h（洗滌液①原料及終濃度：20 mmol/L Tris、10 mmol/L EDTA、0.1 mol/L NaCl、1%TritonX-100）。包涵體沉淀和洗滌液①在2～8 ℃條件下，以1.2×104r/min 離心10 min，收集沉淀。包涵體沉淀和洗滌液②按照質(zhì)量體積比1∶20 在冰上攪拌洗滌2 h（洗滌液②原料及終濃度：20 mmol/L Tris、10 mmol/L EDTA、0.1 mol/L NaCl、2 mol/L 尿素）。包涵體沉淀和洗滌液②在2～8 ℃條件下，以1.2×104r/min 離心10 min，收集沉淀。洗滌后沉淀和裂解液按照質(zhì)量體積比1∶20 重懸（裂解液原料及終濃度：50 mmol/L Tris-HCl、7 mmol/L GuHCl、1 mmol/L EDTA、0.5%β-巰基乙醇）。低溫下利用磁力攪拌至全部溶解后，于2～8 ℃條件下，以1.35×104r/min 離心30 min，收集上清液。緩慢攪動，將變性蛋白液加入復(fù)性液中（復(fù)性液原料及終濃度：50 mmol/L Tris、0.1 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、6 mmol/L半胱氨酸、0.5 mol/L精氨酸、0.6 mmol/L 胱氨酸），于4 ℃冰箱中復(fù)性72 h。利用超濾膜對復(fù)性蛋白液進行超濾濃縮，并以0.22 μm 孔徑濾膜除菌，過濾除菌后的復(fù)性蛋白液置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.7 酶活反應(yīng)產(chǎn)物的氣相色譜-質(zhì)譜分析

超聲破碎得到待檢測蛋白溶液后，向其加入50 μL 檢測緩沖液和一定量的MgCl2、Na2WO4、NaF、FPP，配置成終溶液為100 μL的待測液，且使得混合液 中 含 有10 μmol/L FPP（或GPP 或GGPP 或ddH2O）、10 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L Na2WO4、0.1 mmol/L NaF、0.05 mmol/L MnCl2、50 mmol/L KCl。將裝有反應(yīng)液的玻璃瓶放入預(yù)熱至30 ℃的水浴鍋中，采用頂空固相微萃取法（head space-solid phase microextraction, HS-SPME）（萃取纖維禁止接觸樣品液面）進行吸附。1 h后，打開氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS）聯(lián)用儀對各個樣品與底物反應(yīng)后產(chǎn)生的萜類化合物進行檢測和分析。GC-MS 色譜條件：采用島津RTX-1MS非極性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 nm×0.25 μm）。預(yù)先設(shè)置進樣口溫度為250 ℃，確定柱箱溫度已采用自動升溫模式程序：反應(yīng)開始時，柱箱溫度設(shè)置為60 ℃，維持3 min；之后，以8 ℃/min的速度升溫，將溫度升至125 ℃；最后以5 ℃/min的速度升溫，將溫度升至240 ℃，此過程保留5 min。用氦氣當(dāng)載氣，氣壓為80 kPa，流速為1 mL/min。進樣方式：進樣不分流，進樣方式一欄選擇手動頂空進樣。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）式離子源，沖擊電壓70 V，離子源溫度200 ℃，接觸表面溫度250 ℃，掃描范圍30～500 amu。待檢測結(jié)束后，定性分析每個質(zhì)譜峰在化合物庫中檢索出的相應(yīng)化合物。每個樣品重復(fù)檢測3次。

1.8 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及亞細(xì)胞定位觀察

以pMD18-T/BoTPSa質(zhì)粒為模板，設(shè)計亞細(xì)胞定位引物對其進行擴增。亞細(xì)胞定位引物上游序列為5′-GCTCTAGAATGAAAACACAGTCACAG CC-3′；下游序列為5′-GGGGTACCTGGAACAGG GTAGACGAGCA-3′。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，酶切回收基因片段。使用T4連接酶將目的基因片段與亞細(xì)胞定位載體Psup1300 相連，反應(yīng)體系為：Psup1300載體1μL，目的基因片段7μL，T4連接酶1μL，T4連接酶緩沖液2μL，ddH2O 9μL。再將轉(zhuǎn)入目的基因的亞細(xì)胞定位載體轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。挑取測序無誤的陽性克隆進行菌液擴繁并提取目的質(zhì)粒。獲取擬南芥原生質(zhì)體懸浮液后，共轉(zhuǎn)化目的質(zhì)粒與標(biāo)志物基因，在弱光下培養(yǎng)8～10 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察BoTPSa基因的亞細(xì)胞定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoTPSa 基因的克隆及其蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

經(jīng)克隆得到的基因序列全長約1 800 bp，與預(yù)期相符。將產(chǎn)物連入pMD18-T 載體上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆。對部分陽性克隆菌液進行測序，其結(jié)果與預(yù)期相符，于是將該基因命名為BoTPSa。利用SMART 和ExPASy-PROSITE 軟 件 對BoTPSa 蛋白的結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果顯示，BoTPSa 蛋白含2個保守結(jié)構(gòu)域：萜類合成酶N 末端結(jié)構(gòu)域和C 端活性結(jié)構(gòu)域（圖1A）。所以，初步確認(rèn)BoTPSa 為萜類合成酶家族成員。BoTPSa蛋白的三級結(jié)構(gòu)如圖1B所示，以甜橙（Citrus sinensis）的檸檬烯合成酶蛋白為模板，它們的序列同源性為43.98%。

2.2 BoTPSa 基因的進化分析

圖1 BoTPSa蛋白的結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)Fig.1 Structural domains and tertiary structure of BoTPSa protein

獲取擬南芥、玉米以及常見的蕓薹屬作物等16種植物的TPS核酸序列并構(gòu)建進化樹。結(jié)果（圖2）表明：BoTPSa基因與蕓薹屬作物的同源基因（如白菜萜類合成酶基因BrTPS、芥菜萜類合成酶基因BnTPS、油菜萜類合成酶基因BjuTPS和黑芥萜類合成酶基因BniTPS）成簇分布，親緣關(guān)系較近，同時也說明蕓薹屬作物α-法呢烯合成酶基因高度保守；與擬南芥AtTPS03基因親緣關(guān)系次之；與百合萜類合成酶基因LhTPS、黃瓜萜類合成酶基因CmTPS13、萵苣香葉烯合成酶基因LsTPS、蘇拉威西蝴蝶蘭萜類合成酶基因PeTPS和文心蘭萜類合成酶基因OhTPS的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。BoTPSa基因與雜交杓蘭萜類合成酶基因CpTPS和木本棉萜類合成酶基因GaTPS6、玉米萜類合成酶基因ZmTPS1、蓖麻萜類合成酶基因RcSeTPS13和江南卷柏萜類合成酶基因SmTPS4位于系統(tǒng)進化樹中的不同分支上，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖2 16種植物中TPS基因的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of TPS genes in 16 plants

2.3 結(jié)球甘藍(lán)BoTPSa 基因的時空表達(dá)規(guī)律

qPCR 結(jié)果顯示：在停止蟲害處理4 h 后，結(jié)球甘藍(lán)的各器官（葉、莖、根）中的BoTPSa基因表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05）；蟲害處理組中葉、莖、根的BoTPSa基因表達(dá)量分別是對照組的11.0 倍、8.1 倍和7.0 倍。在停止蟲害處理8 和20 h 后，甘藍(lán)BoTPSa基因表達(dá)量仍然顯著上調(diào)，但誘導(dǎo)表達(dá)水平隨著時間延長呈下降趨勢（圖3）。蚜蟲的取食危害也能顯著誘導(dǎo)BoTPSa基因表達(dá)量的上調(diào)；試驗發(fā)現(xiàn)，結(jié)球甘藍(lán)葉中的BoTPSa基因表達(dá)水平可受低溫（4 ℃）和高溫（38 ℃）影響而明顯上調(diào)（P＜0.05）（圖4），但上調(diào)幅度不如小菜蛾蟲害誘導(dǎo)。

2.4 結(jié)球甘藍(lán)BoTPSa 蛋白的表達(dá)

圖3 小菜蛾誘導(dǎo)結(jié)球甘藍(lán)葉、莖、根BoTPSa 基因的相對表達(dá)量Fig.3 Relative transcript levels of BoTPSa gene in leaves,stems and roots of B. oleracea induced by diamond back moth

根據(jù)BoTPSa基因序列密碼子適應(yīng)性指數(shù)分析，該序列不適合在大腸埃希菌中高效表達(dá)（CAI=0.56），所以需要對其密碼子進行優(yōu)化。優(yōu)化后BoTPSa基因序列的CAI=0.97，說明該序列在大腸埃希菌內(nèi)能夠高效表達(dá)目的蛋白。經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，未分離的重組目的蛋白在分子質(zhì)量82 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，且在分離后的重組蛋白沉淀中發(fā)現(xiàn)了相同的條帶。說明通過優(yōu)化密碼子以及連接融合標(biāo)簽蛋白的方法，成功使得BoTPSa 在大腸埃希菌中高表達(dá)，但是仍然無法實現(xiàn)可溶性表達(dá)。在16 ℃、220 r/min搖床振蕩16 h和在37 ℃、220 r/min搖床振蕩16 h 情況下，依舊為包涵體表達(dá)（圖5A）；且梯度IPTG 濃度誘導(dǎo)結(jié)果顯示無顯著差異（圖5B），因此，本試驗對包涵體進行復(fù)性以獲得具有活性的蛋白樣品Trx-BoTPSa。

圖4 外界因素誘導(dǎo)結(jié)球甘藍(lán)葉中BoTPSa基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative transcript levels of BoTPSa gene in leaves of B.oleracea induced by external stresses

2.5 結(jié)球甘藍(lán)BoTPSa 蛋白的包涵體復(fù)性

在37 ℃、0.1 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)條件下，大量誘導(dǎo)培養(yǎng)重組Trx-BoTPSa 菌種，破菌后進行包涵體復(fù)性以獲得具有活性的蛋白樣品。對復(fù)性樣品采用超濾濃縮法（20 kDa超濾膜）進行超濾后，獲得特異性條帶清晰、質(zhì)量濃度約1×103mg/L 的Trx-BoTPSa樣品（圖5C）。

2.6 酶活反應(yīng)產(chǎn)物氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果

使用頂空固相微萃取法吸附酶活反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)合GC-MS技術(shù)來分析酶活反應(yīng)液中產(chǎn)生的萜類的種類。用HS-SPME 纖維吸附各樣品1 h 后，取出HS-SPME萃取頭，在GC-MS儀器上手動進樣分析酶活反應(yīng)產(chǎn)物。獲得的質(zhì)譜圖如圖6所示。以FPP純品為對照的樣品中無產(chǎn)物峰（圖6A），而以稀釋1×104倍的法呢烯與烯烴混合液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品的產(chǎn)物峰圖如6B 所示，在提?。?3.0±0.7）m/z范圍內(nèi)的離子流后，發(fā)現(xiàn)在以FPP 為底物的樣品中產(chǎn)生了多個產(chǎn)物峰（圖6C）。對比檢測到的化合物的保留時間和離子提取峰后發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)的BoTPSa 能以FPP為底物生成草烯、β-法呢烯、α-法呢烯。

圖5 融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE檢測Fig.5 SDS-PAGE detection of the expressed fusion protein

圖6 重組BoTPSa酶催化產(chǎn)物的GC-MS分析Fig.6 GC-MS analysis of enzymatic reaction product of recombinant BoTPSa

2.7 BoTPSa 的亞細(xì)胞定位分析

通過帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein,GFP）標(biāo)簽的目的基因與細(xì)胞核標(biāo)志物基因共轉(zhuǎn)擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到，BoTPSa 熒光與細(xì)胞核標(biāo)志物熒光并不重合（圖7A），證明BoTPSa基因不在細(xì)胞核中表達(dá)。再通過帶GFP標(biāo)簽的目的基因轉(zhuǎn)入擬南芥以后，在激光共聚焦顯微鏡下觀測GFP 熒光與葉綠體自發(fā)熒光的位置發(fā)現(xiàn)，BoTPSa 熒光與標(biāo)志物熒光并不重合（圖7B），說明BoTPSa基因也不在葉綠體中表達(dá)。

圖7 BoTPSa在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of BoTPSa in protoplast of A.thaliana

3 討論

萜類化合物是自然界中種類最多、結(jié)構(gòu)最多樣的一類化合物[21]。萜類合成酶作為植物萜類化合物合成過程中的關(guān)鍵酶，它決定著萜類化合物的結(jié)構(gòu)和種類[22]。隨著植物基因組測序的深入發(fā)展，學(xué)者們能獲取植物中萜類合成酶的基因序列，并對其功能特性進行深入解析。目前，雖然萜類合成酶基因已被廣泛鑒定，但其在蕓薹屬植物中的功能研究尚未深入。本研究在結(jié)球甘藍(lán)中鑒定出了α-法呢烯合成酶基因BoTPSa，通過預(yù)測其結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白序列含有高度保守的N端結(jié)構(gòu)域和C末端活性結(jié)構(gòu)域，與前人對TPS結(jié)構(gòu)的保守區(qū)域的研究結(jié)果相符[23]。同時，本研究分析了該基因與其他作物的萜類合成酶基因的親緣關(guān)系，并對它的表達(dá)受蟲害處理和脅迫處理的影響進行了解析。

隨著眾多的植物萜類合成酶的生物學(xué)功能被相繼揭示，其應(yīng)用也得到了研究者們的關(guān)注。然而，植物中萜類合成酶表達(dá)水平相對較低、提取步驟復(fù)雜、人工提取效率低等問題制約著萜類化合物的廣泛應(yīng)用。而高效率、易改造的原核表達(dá)系統(tǒng)為異源合成萜類化合物提供了有效的解決途徑。如WONG等[24]研究發(fā)現(xiàn)，將外源萜類合成酶基因轉(zhuǎn)入大腸埃希菌可大幅提升其對應(yīng)的萜類化合物的合成效率。徐婭瑩[25]發(fā)現(xiàn)，佛手的CmTPSl 重組蛋白能夠以FPP為底物生成以雙環(huán)牻牛兒烯為主的多種倍半萜化合物。本研究利用大腸埃希菌成功異源表達(dá)了結(jié)球甘藍(lán)BoTPSa 蛋白，并檢測發(fā)現(xiàn)該酶能以FPP 為底物，催化合成多個倍半萜烯類化合物。其中，β-法呢烯已被發(fā)現(xiàn)參與到植物與昆蟲的互作中[26]，而草烯在結(jié)球甘藍(lán)抗蟲反應(yīng)中的作用尚不清楚。

基于體外酶活試驗的結(jié)果，我們推測結(jié)球甘藍(lán)的BoTPSa可能是一個多功能酶。植物的萜類合酶在植物體內(nèi)可同時介導(dǎo)多個揮發(fā)物的合成，這些揮發(fā)物通過綜合作用來影響植食者，如雙條杉天牛（Semanotus bifasciatus）對單一的倍半萜化合物不具趨性，但這些倍半萜的混合物卻能引誘大量的雙條杉天牛[27]，說明萜類化合物之間具有增效效應(yīng)。所以，我們推測α-雪松烯、γ-依蘭烯、沒藥烯、γ-欖香烯、羅漢柏烯和布藜烯的混合可以增強α-法呢烯調(diào)控的結(jié)球甘藍(lán)-害蟲互作，它們之間具體的聯(lián)系仍需進一步的探究。當(dāng)然，由于萜類合酶在植物細(xì)胞內(nèi)的功能與其能獲得的底物有關(guān)，BoTPSa 在體外和植物體內(nèi)的酶活產(chǎn)物的類型不一定相同。

萜類合酶在植物體內(nèi)主要位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中，分別利用其中的甲羥戊酸途徑和甲基赤蘚醇4-磷酸途徑的產(chǎn)物作為底物來合成不同類型的萜類[28]。因此，萜類合酶在細(xì)胞內(nèi)的分布對于其產(chǎn)物類型有著重要的影響[29]。BoTPSa 亞細(xì)胞定位為BoTPSa 蛋白的分子功能解析提供了線索，并為其他萜類合成酶基因功能的解析提供了參考依據(jù)。為解析BoTPSa 蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的分布，我們使用擬南芥原生質(zhì)體懸浮液瞬時表達(dá)BoTPSa 蛋白，并對其亞細(xì)胞定位進行跟蹤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該BoTPSa不在細(xì)胞核和葉綠體中表達(dá)，其表達(dá)的位置有待后續(xù)進一步的研究。

4 結(jié)語

本研究結(jié)果表明，結(jié)球甘藍(lán)BoTPSa基因與十字花科植物擬南芥以及多種蕓薹屬植物的同源萜類合酶基因在核酸序列水平上高度相似，說明其功能在十字花科植物中可能十分保守。而BoTPSa基因表達(dá)受蟲害所誘導(dǎo)，在應(yīng)對非生物脅迫中，本研究發(fā)現(xiàn)低溫和高溫處理均能誘導(dǎo)BoTPSa基因的表達(dá)，說明其可能參與抗蟲和抗溫度脅迫的生態(tài)反應(yīng)。原核表達(dá)BoTPSa 蛋白和生化研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白能催化底物FPP 生成多種倍半萜類揮發(fā)物，說明其可能是一個多功能酶。對BoTPSa蛋白的亞細(xì)胞定位表明，BoTPSa 蛋白不在細(xì)胞核和葉綠體中，其亞細(xì)胞定位有待后續(xù)研究。本研究為深入解析甘藍(lán)的萜類次生代謝化合物合成機制提供了理論依據(jù)。