兔支氣管敗血波氏桿菌外膜囊泡的制備及其蛋白質(zhì)成分分析

南黎，黃葉娥，肖琛聞，王志鵬，韋強(qiáng)，季權(quán)安，李科，劉燕*，鮑國連*

（1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021）

支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）是一種需氧、高度傳染性的革蘭陰性菌，常見于各種家畜和野生哺乳動(dòng)物的上呼吸道，可引起哺乳動(dòng)物呼吸道感染，如造成兔和豚鼠的氣管支氣管炎（鼻塞）、狗的犬支氣管肺炎（犬舍咳嗽）以及豬的鼻甲萎縮[1]等；還可感染免疫功能低下者，造成嚴(yán)重的肺部疾病，甚至危及生命[2]。在規(guī)模化養(yǎng)兔場中，波氏桿菌在我國多個(gè)省的兔群中普遍存在，給養(yǎng)殖戶造成極大經(jīng)濟(jì)損失，已成為兔病防治的一大難題。而預(yù)防該疾病最有效的措施是接種疫苗。目前，市面上針對(duì)兔波氏桿菌的獸用疫苗主要是滅活苗，雖然大部分滅活苗能夠引起高血清抗體滴度，但持續(xù)時(shí)間短，保護(hù)率低[3]。由于這種病菌對(duì)人類和動(dòng)物的健康造成重大影響，故亟須研發(fā)有效的新型疫苗。

外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）是細(xì)菌生長過程中分泌的一種直徑介于10～300 nm之間的球形結(jié)構(gòu)，其無生命活性并且不可復(fù)制，在不同溫度和處理下都能保持完整和穩(wěn)定[4-5]。OMVs包含蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、酶和肽聚糖等細(xì)菌成分[6-7]，能夠有效引起機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[8-10]，使其成為潛在的新型疫苗候選者。許多研究顯示，OMVs 是有前景的對(duì)抗細(xì)菌感染的疫苗候選者，例如對(duì)抗流感嗜血菌、多殺巴斯德菌、霍亂弧菌、產(chǎn)腸毒素的大腸埃希菌、百日咳博代桿菌和鼠傷寒沙門菌[11-15]。腦膜炎奈瑟菌的外膜囊泡（OMVs）已經(jīng)被成功研發(fā)成商品化的疫苗，這充分說明OMVs 在疫苗的研發(fā)方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。OMVs對(duì)于兔波氏桿菌新型亞單位疫苗的研究將具有積極的意義。

OMVs的產(chǎn)生一般是細(xì)菌對(duì)包膜作用壓力的普遍反應(yīng)，往往由多種生存條件引起。當(dāng)細(xì)菌處于惡劣的環(huán)境時(shí)，各種應(yīng)激因素如溫度、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有害化學(xué)物質(zhì)的暴露均可誘導(dǎo)產(chǎn)生OMVs[16]。目前，OMVs 的生產(chǎn)存在產(chǎn)量低、成本高等缺陷[17]。為此，本研究擬通過對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化及生長環(huán)境的改變，最大化提高OMVs 的產(chǎn)量，建立兔波氏桿菌OMVs 最佳制備工藝，為后續(xù)工業(yè)化大規(guī)模批量生產(chǎn)兔波氏桿菌OMVs 奠定基礎(chǔ)；揭示兔波氏桿菌OMVs 的理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)組成，以期為基于OMVs的兔波氏桿菌疫苗設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)信息和潛在策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及主要試劑

兔波氏桿菌強(qiáng)毒株FX-1由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定并保存。胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar, TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth,TSB）、胰蛋白胨（tryptone）購自美國賽默飛世爾科技有限公司；蛋白胨B、蔗糖購自上海市BBI 生命科學(xué)有限公司；Mueller-Hinton（MH）肉湯、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；頭孢氨芐（98%）購自上海源葉生物科技有限公司；Tris-乙二胺四乙酸（Tris-ethylene diamine tetraacetic acid,TE）緩沖液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；脫氧膽酸鈉購自德國Sigma-Aldrich公司；4%～12%ExpressPlusTM蛋白預(yù)制膠、Mops電泳緩沖液購自南京金斯瑞生物科技有限公司；分子標(biāo)志物購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

SpectraMax M5 Model 550 酶標(biāo)檢測儀購自美國Molecular Devices公司；超濾管（100 kDa）購自美國Millipore公司；Forma 702超低溫冰箱購自美國賽默飛世爾科技有限公司；eStain L1蛋白染色儀購自南京金斯瑞生物科技有限公司；PowerLook 2100XL-USB掃描儀購自臺(tái)灣省力廣科技股份有限公司；CR21GⅡ高速冷凍離心機(jī)、CP100WX超速冷凍離心機(jī)和H7650透射電子顯微鏡購自日本日立公司；GNP-9270 恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZ-9210K、DHZ-CA恒溫?fù)u床購自江蘇省太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；EPS 601電泳儀購自美國GE Healthcare公司；ZetaView PMX 110納米顆粒追蹤分析儀購自德國Particle Metrix公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 OMVs 制備方法的篩選

將兔波氏桿菌FX-1菌株劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）平板上，于37 ℃條件下培養(yǎng)36 h，挑取單菌落接種于2 mL 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)10 h后，按體積比1∶100 擴(kuò)大培養(yǎng)200 mL 菌液。采用稀釋涂布分離計(jì)數(shù)法測定細(xì)菌培養(yǎng)中菌落形成單位（colony forming unit, CFU）的數(shù)量。將菌液倍比稀釋，取1×106、1×107、1×108這3個(gè)稀釋度的菌液各100 μL涂布于TSA 平板并計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3 次并進(jìn)行活菌數(shù)測定。分別采用超聲破碎法和超濾濃縮法制取兔波氏桿菌OMVs，方法如下。

超聲破碎法：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長末期的200 mL菌液計(jì)數(shù)后，在4 ℃條件下，以1×104g離心20 min，棄上清液；沉淀用TE 緩沖液復(fù)蘇，在冰水中超聲20 min后，在4 ℃條件下，以1×104g離心30 min，取上清液；以0.45 μm 的濾器過濾，并將濾液在4 ℃條件下，以4×104g超速離心3 h；將收集的沉淀重懸在溶有1.5%的脫氧膽酸鹽的TE緩沖液中，每6 mL重懸液加2 mL 60%的蔗糖溶液，在4 ℃條件下，以1×105g超速離心2 h；OMVs 出現(xiàn)在TE/蔗糖界面，將其收集到Eppendorf管中，并于－80 ℃條件下保存，待用。

超濾濃縮法：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長末期的200 mL菌液計(jì)數(shù)后，在4 ℃條件下，以1×104g離心20 min，取上清液；經(jīng)0.45 μm的濾器過濾后，收集到超濾管（截留分子質(zhì)量為100 kDa）中，在4 ℃條件下，以5 000g離心20 min，以濃縮濾液；接著在4 ℃條件下，以1×105g超速離心2 h，棄上清液；沉淀用TE 緩沖液重懸，于－80 ℃條件下凍存。

通過比較分析用這2種方法制備的OMVs蛋白含量及成分，篩選最優(yōu)制備方法。

1.2.2 OMVs 制備條件的優(yōu)化

確立較適制備方法后，對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、抗生素的添加量、過濾方法等條件進(jìn)行逐一優(yōu)化，確立兔波氏桿菌OMVs最佳制備工藝。

1.2.2.1 最佳培養(yǎng)時(shí)間的確定

將分離保存的兔波氏桿菌菌株FX-1 劃線接種于TSA平板上，于37 ℃條件下培養(yǎng)36 h，挑取單菌落接種于2 mL TSB 培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下，以200 r/min 搖床培養(yǎng)10 h 后，按體積比1∶100 擴(kuò)大培養(yǎng)200 mL菌液，培養(yǎng)時(shí)間分別選取對(duì)數(shù)生長末期附近14、16、18、20、22 h，計(jì)數(shù)后按上述超濾濃縮法制備兔波氏桿菌OMVs。通過測定不同培養(yǎng)時(shí)間下制備的OMVs蛋白含量，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.2.2 最佳抗生素添加量的確定

首先需要確定所使用抗生素的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）。在無菌條件下，將兔波氏桿菌劃線于TSA平板上，置于37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)，以達(dá)到分離純化的目的；然后用接菌環(huán)挑取單個(gè)典型菌落接種于5 mL MH 肉湯是，置于37 ℃恒溫?fù)u床中過夜培養(yǎng)；最后用分析天平稱取0.128 g 頭孢氨芐（98%），溶于10 mL 超純水中，配成終質(zhì)量濃度為12.8 mg/mL的儲(chǔ)備液10 mL，分裝后保存于－80 ℃冰箱中，備用。

采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度，操作過程及結(jié)果判讀嚴(yán)格按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，具體步驟如下：將MH肉湯培養(yǎng)的菌液稀釋到0.5 麥?zhǔn)媳葷岫?，然后將MH 肉湯以體積比1∶1 000稀釋，使其濃度達(dá)到1×105CFU/mL。取滅菌的96孔板置于無菌操作臺(tái)上，向第1 孔加入8 μL 12.8 mg/mL 的頭孢氨芐和92 μL 的MH 肉湯（頭孢氨芐質(zhì)量濃度為1 024 μg/mL），其他第2—11 孔分別加入50 μL MH 肉湯，然后從第1 孔吸取50 μL 至第2孔，依次倍比稀釋，到第10孔時(shí)棄去50 μL，第11孔只加入50 μL MH肉湯，然后每孔加入50 μL的菌液（第1—11 孔中頭孢氨芐的質(zhì)量濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0 μg/mL），第11 孔作為陽性對(duì)照，第12孔僅加入空白肉湯100 μL作為陰性對(duì)照。將96 孔板密封，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20～24 h后判定結(jié)果，記錄細(xì)菌濁度值[D（600 nm）][18]。每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次。結(jié)果以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。當(dāng)出現(xiàn)單一跳孔時(shí)，記錄抑制細(xì)菌生長的最高藥物濃度為MIC。

確定頭孢氨芐對(duì)兔波氏桿菌的MIC 后，設(shè)定5個(gè)濃度，分別為1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC，以最佳培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)，計(jì)數(shù)后按上述超濾濃縮法制備兔波氏桿菌OMVs，通過測定不同頭孢氨芐濃度下制得的OMVs 蛋白含量，確定頭孢氨芐的最佳添加量。

1.2.2.3 最佳過濾方法的確定

設(shè)計(jì)2組試驗(yàn)，在制備兔波氏桿菌OMVs時(shí)，將上清液分別用0.45和0.22 μm 2種濾器過濾，比較不同濾膜過濾后的OMVs 溶液中的蛋白質(zhì)含量；同時(shí)，為確保得到的OMVs 中沒有活菌，將1 mL 濾液置于TSA 平板上，于37 ℃條件下孵育過夜。最終確定最佳濾膜孔徑大小。

1.2.3 OMVs 的理化性質(zhì)分析

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

分別用透射電鏡（transmission electron microscope, TEM）和掃描電鏡（scanning electron microscope,SEM）對(duì)OMVs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

取10 μL OMVs 樣品滴在蠟紙上，將銅網(wǎng)與樣品液表面接觸，靜置3～5 min，用濾紙吸去多余的樣品。用2%的磷鎢酸對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染色，晾干后在H7650 透射電鏡下觀察OMVs 的形態(tài)，用高靈敏度電荷耦合器件（charge-coupled device,CCD）相機(jī)記錄試驗(yàn)結(jié)果。將OMVs 用樣品固定液固定，經(jīng)脫水、干燥后，將其緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上并放入離子濺射儀樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金30 s左右，通過SEM觀察OMVs的表面結(jié)構(gòu)。

1.2.3.2 Zeta電位和納米顆粒追蹤分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）

將OMVs 樣品用1×磷酸鹽緩沖液稀釋1×104倍，進(jìn)樣檢測，在11個(gè)位置重復(fù)測量2次，用相應(yīng)的軟件ZetaView 8.04.02進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)溫度保持在25 ℃左右。

1.2.3.3 OMVs蛋白含量的測定與分析

使用Bradford蛋白檢測試劑盒檢測OMVs蛋白含量。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。將OMVs 樣品作適當(dāng)稀釋，加20μL到樣品孔中；再加入200μL 1×G250 染色液，室溫放置3～5 min；用酶標(biāo)儀測定595 nm 波長下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出OMVs樣品中的蛋白質(zhì)含量，再按每菌落形成單位的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量。試驗(yàn)溫度保持在25 ℃左右。

通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）對(duì)兔波氏桿菌OMVs 樣品的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行初步分析。取80 μL樣品加入20 μL 5×上樣緩沖液，于100 ℃水浴鍋中煮沸20 min，置冰上冷卻10 min，以備上樣。將4%～12%ExpressPlusTM蛋白預(yù)制膠放入電泳槽，倒入Tris-3-嗎啉丙磺酸-十二烷基硫酸鈉（Tris-MOPS-SDS）緩沖液，依次加入分子標(biāo)志物和OMVs 樣品，各蛋白樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。在150 V電壓下電泳50 min。

為進(jìn)一步鑒定OMVs 中所含的蛋白質(zhì)成分，將OMVs樣品交由上海中科新生命生物科技有限公司，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatographytandem mass spectrometry,LC-MS/MS）進(jìn)行檢測分析。質(zhì)譜測試原始文件用Mascot 2.2 和Proteome Discoverer 1.4 軟件進(jìn)行查庫鑒定及定量分析，針對(duì)UniProt 的Bordetella bronchiseptica（下載21 311 個(gè) 條目）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。采用以下方法鑒定OMVs 中的蛋白質(zhì)：允許2個(gè)缺失的胰蛋白酶切割位點(diǎn)，肽質(zhì)量容差為20，質(zhì)譜/質(zhì)譜容差為0.1 Da，設(shè)置蛋氨酸氧化、N端乙?；桶腚装彼岚被柞；墓潭ㄐ揎?，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate,FDR）≤0.01。通過肽段質(zhì)譜匹配（peptide spectrum matches,PSMs）的數(shù)量來評(píng)估OMVs中蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確性，匹配得越好，可信度越高；篩選前30 PSMs的蛋白質(zhì)作為OMVs主要蛋白進(jìn)行分析。使用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)OMVs中蛋白質(zhì)分子功能、細(xì)胞成分及生物過程進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）功能注釋和富集分析，每個(gè)類別的x軸按照P值（P＜0.05）從上到下排序，上面的差異更明顯，y軸表示每個(gè)類別的蛋白數(shù)量和蛋白總數(shù)的百分比。

考慮服務(wù)請(qǐng)求者的個(gè)性化需求，采用權(quán)重分配法來描述請(qǐng)求者的愿望。將所構(gòu)建的多屬性決策矩陣與服務(wù)請(qǐng)求者所設(shè)定的權(quán)重分配數(shù)值進(jìn)行相乘然后再將計(jì)算出的單個(gè)QoS屬性評(píng)價(jià)結(jié)果相加，得到Web服務(wù)綜合評(píng)價(jià)值。如評(píng)價(jià)公式(8)所示

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用ZetaView 8.04.02 軟件進(jìn)行納米顆粒追蹤分析；采用Mascot 2.2 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析；采用GraphPad Prism 8和OriginLab Origin 8.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OMVs 最優(yōu)制備工藝的建立

從圖1A中可以看出：培養(yǎng)時(shí)間在16～22 h之間時(shí)，每菌落形成單位（CFU）Bb產(chǎn)生的OMVs蛋白含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈先增加后下降的趨勢(shì)，在18 h時(shí)達(dá)到最大值，故而18 h為最佳培養(yǎng)時(shí)間。在前期確定頭孢氨芐MIC 的基礎(chǔ)上（MIC=128 μg/mL），隨著頭孢氨芐質(zhì)量濃度的增大，每菌落形成單位（CFU）Bb產(chǎn)生的OMVs 蛋白含量也隨之增大（圖1B）；在64 μg/mL頭孢氨芐處理下，每菌落形成單位（CFU）Bb產(chǎn)生的OMVs 蛋白含量比128 μg/mL 時(shí)的低，但實(shí)際蛋白質(zhì)含量從1 634.91 μg（菌液量為2.12×109CFU）降低為389.59 μg（菌液量為4×108CFU），總蛋白量顯著降低，因而64 μg/mL為頭孢氨芐最佳添加量。從圖1C～D可知，0.45 μm濾膜處理的每菌落形成單位（CFU）Bb產(chǎn)生的OMVs 蛋白含量遠(yuǎn)高于0.22 μm濾膜處理組，且2組濾液中均沒有檢測到活菌，因此，使用0.45 μm濾膜過濾一次更為經(jīng)濟(jì)。

綜上所述，兔波氏桿菌OMVs最佳制備條件為：培養(yǎng)時(shí)間18 h，頭孢氨芐的添加量64 μg/mL，使用0.45 μm濾膜過濾一次。

圖1 OMVs最優(yōu)制備工藝的建立Fig.1 Establishment of the optimum preparation technic of OMVs

2.2 OMVs 的理化性質(zhì)

2.2.1 OMVs 的TEM、SEM 和NTA 觀察結(jié)果

從圖2A～B可知：OMVs呈球形囊泡狀，直徑介于10～300 nm之間，平均直徑為127.83 nm±0.68 nm；NTA結(jié)果顯示，樣品含量達(dá)到（9.97±0.05）×1012mL－1（圖2C），Zeta電勢(shì)為－36.40 mV±0.75 mV（圖2D）。

2.2.2 OMVs 中的蛋白質(zhì)成分分析

將2 種方法提取的OMVs 進(jìn)行SDS-PAGE 和LC-MS/MS 分析。從圖3 中可知：2 種方法提取的OMVs 主要蛋白條帶大小大致相同，而超聲法提取的OMVs 與超濾濃縮法相比存在明顯的雜條帶。這歸結(jié)于超聲法制得的OMVs 不僅包含細(xì)菌本身分泌的外膜囊泡，還包括了在超聲環(huán)境中誘導(dǎo)形成的囊泡狀結(jié)構(gòu)。結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果分析，構(gòu)成兔波氏桿菌OMVs 的蛋白質(zhì)有多種，表1 列出了PSMs 前30的蛋白質(zhì)成分。其中，絲狀血凝素、黏附素、侵襲素、外膜蛋白A、自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、絨毛蛋白以及主要蛋白條帶P60 經(jīng)質(zhì)譜鑒定為60 kDa 伴侶蛋白（GroEL），P40 為鞭毛蛋白，這些保護(hù)性抗原大多是兔波氏桿菌中已知的毒力相關(guān)蛋白。此外，質(zhì)譜鑒定出的腺苷酸環(huán)化酶溶血素（adenylate cyclasehemolysin,AC-Hly）、外膜孔蛋白、脂蛋白、脂質(zhì)A脫酰酶PagL、假定的氨基酸ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)可溶性結(jié)合蛋白、賴氨酸/異亮氨酸/纈氨酸結(jié)合蛋白等均是兔波氏桿菌OMVs中具有潛力的免疫原性蛋白。

由于超濾濃縮法制得的OMVs 相對(duì)純度較高，包含多種免疫原性蛋白，且該方法相對(duì)超聲法更簡單，為后續(xù)規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用提供了可能，故而選擇超濾濃縮法用于后續(xù)研究。

從圖4A中可知：OMVs蛋白的生物學(xué)過程富集于蛋白質(zhì)、核酸等生物合成及代謝過程，部分參與膜構(gòu)建和膜內(nèi)蛋白插入過程，猜測其與外膜囊泡的合成相關(guān)。從細(xì)胞成分上看，OMVs 蛋白富集于核糖體、細(xì)胞外膜以及外部封裝結(jié)構(gòu)上，其分子功能為參與核糖體的結(jié)構(gòu)組成及小分子結(jié)合等（圖4B～C），證實(shí)OMVs上的蛋白質(zhì)是由核糖體參與合成的。

圖2 超濾濃縮法制OMVs的TEM、SEM和NTA觀察結(jié)果Fig.2 TEM, SEM images and NTA observation of OMVs prepared by centrifugal ultrafiltration

3 討論

圖3 SDS-PAGE 分析超濾濃縮法和超聲破碎法制得的OMVs蛋白條帶Fig.3 SDS-PAGE analysis of OMVs protein bands prepared by centrifugal ultrafiltration and ultrasonication

近年來，以納米顆粒為基礎(chǔ)的治療方法引起了研究者們的極大關(guān)注。這些幫助小分子、多肽和蛋白質(zhì)衍生藥物傳遞的納米粒子，如樹狀大分子、聚合物納米顆粒、無機(jī)納米顆粒，具有類似的靶向性和治療藥物裝載特性，但它們?cè)诙拘曰蛏锴宄龁栴}上存在局限性，脂質(zhì)納米顆粒（如脂質(zhì)體）能夠消除納米顆粒的清除問題，但存在生產(chǎn)復(fù)雜、成本高等缺陷[19]。

細(xì)菌OMVs 是在近半個(gè)世紀(jì)前被發(fā)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，OMVs 在發(fā)病機(jī)制、細(xì)胞間通信、藥物遞送載體、疫苗開發(fā)、毒力因子傳遞等方面具有重要意義，在臨床和其他相關(guān)領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。這種由細(xì)菌外膜釋放，具有與親本細(xì)胞膜相似的蛋白質(zhì)、脂多糖（LPS）和脂質(zhì)的納米囊泡，其表面表達(dá)的病原體相關(guān)分子模式可以激活Toll 樣受體（Tolllike receptor, TLR）信號(hào)，促進(jìn)OMVs 進(jìn)入宿主細(xì)胞[20]，有效引起機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。例如，產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（STEC）OMVs可作為疫苗用于保護(hù)小鼠和黏菌群免受溶血性尿毒綜合征的侵襲[21]，從百日咳桿菌中分離到的OMVs 能使小鼠有效抵抗該菌的感染[22]。此外，細(xì)菌OMVs 可裝載抗原、重組蛋白或藥物。通過基因改造，在OMVs 表面表達(dá)多種靶向分子，實(shí)現(xiàn)選擇性靶向遞送藥物，同時(shí)為制備多價(jià)疫苗提供可能。如KIM等[23]通過基因修飾來消除細(xì)菌內(nèi)毒素功能，不僅增加了OMVs 的安全性，也顯著誘導(dǎo)了小鼠長期抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力。裝載多種毒力因子的具核梭桿菌OMVs，能夠利用病原體毒力因子的抗原性生產(chǎn)有效疫苗而對(duì)抗結(jié)直腸癌[24]。GUJRATI等[25]發(fā)現(xiàn)，表面有抗HER2 親合體的OMVs 可以選擇性地傳遞到腫瘤細(xì)胞。這種細(xì)菌能夠自主合成脂質(zhì)，產(chǎn)生囊泡外表面的靶向配體，表達(dá)并包裝囊

泡內(nèi)包膜的重組蛋白，這是任何其他載體都難以實(shí)現(xiàn)的，使OMVs成為一種極有前途的納米載體。

表1 超濾濃縮法制得的兔波氏桿菌OMVs主要蛋白質(zhì)鑒定Table 1 Main proteins identified in OMVs from Bb prepared by centrifugal ultrafiltration

圖4 基于基因本體論（GO）的兔波氏桿菌OMVs蛋白的功能注釋和富集分析Fig.4 Functional annotation and enrichment analysis of the proteins in the OMVs from Bb based on gene ontology(GO)

波氏桿菌是革蘭陰性菌，常見于哺乳動(dòng)物的呼吸道中，該菌極易傳播，宿主范圍廣泛。本研究圍繞兔波氏桿菌OMVs 的制備開展相關(guān)研究，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)估。采用超聲破碎法和超濾濃縮法2 種方法分別收集兔波氏桿菌OMVs，通過TEM和SEM觀察發(fā)現(xiàn)，2種方法均能成功提取到OMVs；SDS-PAGE 分析顯示，用這2 種方法提取的OMVs主要蛋白條帶大小大致相同，而超聲法提取的OMVs 較超濾濃縮法純度低，因?yàn)槌暦ㄖ频玫腛MVs 不僅包含細(xì)菌本身分泌的外膜囊泡，還包括了在超聲環(huán)境中誘導(dǎo)形成的囊泡狀結(jié)構(gòu)，因而其蛋白成分更為復(fù)雜。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，超濾濃縮法提取的OMVs，其主要蛋白包含了絲狀血凝素、黏附素、外膜孔蛋白、脂蛋白、鞭毛蛋白等兔波氏桿菌中重要的免疫原性蛋白；并且超濾濃縮法相對(duì)超聲法操作更為簡單，為后續(xù)規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用提供了可能，故而我們選擇超濾濃縮法用于后續(xù)研究中。在對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、抗生素添加量及過濾方法進(jìn)行逐一優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間為18 h，頭孢氨芐質(zhì)量濃度為64 μg/mL，以及采用0.45μm 濾膜過濾一次時(shí)，顯著提升了OMVs的產(chǎn)量。

本研究制得的OMVs 呈納米級(jí)球形囊泡，平均直徑為127.83 nm±0.68 nm。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，超濾濃縮法制得的OMVs 具有多種與疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)的多肽。其中，OMVs 蛋白中有很多絲狀血凝素，這類蛋白是兔波氏桿菌的毒力決定因子，它已作為一種成分被列入大多數(shù)非細(xì)胞性疫苗中[26]。黏附素和侵襲素與細(xì)胞間通信、刺激免疫反應(yīng)以及一些毒力和感染機(jī)制有關(guān)[27]。60 kDa 伴侶蛋白（GroEL）是兔波氏桿菌OMVs 的主要成分，可促進(jìn)多肽的重新折疊和裝配，同時(shí)，其作為兔波氏桿菌毒力相關(guān)蛋白，OMVs 誘導(dǎo)的免疫血清能夠識(shí)別GroEL 抗原[28]。鞭毛蛋白是一種有效的促炎因子，能夠誘導(dǎo)趨化因子、細(xì)胞因子和宿主防御基因的表達(dá)[29]。自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、絨毛蛋白以及含β桶域的自主轉(zhuǎn)運(yùn)外膜蛋白定位于細(xì)胞外膜，具有自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白域，這類蛋白是典型的毒力因子，與致病菌的感染或毒力相關(guān)。外膜蛋白A（OmpA）可能與OMVs 的生物合成有關(guān)，同時(shí)也是一個(gè)有潛力的保護(hù)性抗原。經(jīng)質(zhì)譜鑒定的假定的氨基酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)可溶性結(jié)合蛋白、外膜孔蛋白、脂蛋白以及賴氨酸/異亮氨酸/纈氨酸結(jié)合蛋白，這些重組蛋白都能誘導(dǎo)高抗體效價(jià)，其中外膜孔蛋白和脂蛋白對(duì)兔波氏桿菌的侵襲具有保護(hù)作用[30]。此外，研究表明，腺苷酸環(huán)化酶溶血素（AC-Hly）、脂質(zhì)A 脫酰酶PagL 也是兔波氏桿菌OMVs 中具有潛力的免疫原性蛋白[31]?？傊貌ㄊ蠗U菌OMVs 本身作為一種納米級(jí)球形囊泡，其包含上述多種與毒力和感染機(jī)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，因而OMVs對(duì)于兔波氏桿菌新型亞單位疫苗的研究將具有積極意義。

綜上所述，本研究建立了兔波氏桿菌OMVs 最佳制備工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能；揭示了兔波氏桿菌OMVs 的理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)組成，為新型亞單位疫苗的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。