烏司他丁對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

穆盛田，唐潔，仲宇，鄭振

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110042）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是危重癥領(lǐng)域一種常見的臨床綜合征，在部分重癥醫(yī)學(xué)科發(fā)病率甚至超過(guò)50%，嚴(yán)重威脅患者的生命安全［1］。膿毒癥是引起AKI的最常見病因，但確切機(jī)制目前尚不清楚［2］。研究［3］顯示，過(guò)度的氧化應(yīng)激和炎性因子大量釋放在膿毒癥導(dǎo)致AKI的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近期研究［4］發(fā)現(xiàn)，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）作為細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白，其相關(guān)信號(hào)通路的激活在氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。近期還有研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，Nrf2可參與預(yù)防各種腎功能不全的發(fā)生發(fā)展，因此Nrf2也成為AKI治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

烏司他丁是臨床危重癥領(lǐng)域常用的廣譜蛋白酶抑制劑，在急重癥胰腺炎、急性循環(huán)衰竭、感染性休克以及多器官功能障礙等多種臨床綜合征的救治中發(fā)揮重要的抗炎和抑制氧化應(yīng)激的作用。前期臨床研究［7］發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可減少心臟手術(shù)后AKI的發(fā)生，但具體機(jī)制尚不清楚。近期有臨床研究［8］發(fā)現(xiàn)，大劑量（160萬(wàn)U/d）烏司他丁可預(yù)防肝移植術(shù)后患者發(fā)生遲發(fā)性急性腎衰竭。且前期對(duì)健康志愿者的研究［9］發(fā)現(xiàn)，大劑量烏司他丁并無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)，這為臨床大劑量應(yīng)用烏司他丁提供了安全保障。本研究的目的是探討不同劑量的烏司他丁對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥AKI的保護(hù)作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

C57BL/6雄性小鼠40只，體質(zhì)量22～25 g，來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。將小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、LPS組（腹腔注射LPS 10 mg/kg）、LPS+5 000 U/kg烏司他丁組和LPS+50 000 U/kg烏司他丁組。本研究中動(dòng)物處理方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑和藥品

LPS（美國(guó)Sigma公司）；烏司他丁（國(guó)藥準(zhǔn)字H19990134，100 000 U/支，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）；Nrf2抗體（英國(guó)Abcam公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）和過(guò)氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。

1.3 血清肌酐（creatinine，Cr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測(cè)

LPS處理24 h后處死小鼠，通過(guò)心腔取血，2 000 r/min下離心20 min后取上清液，應(yīng)用羅氏自動(dòng)生化檢測(cè)儀（瑞士羅氏公司）檢測(cè)各組小鼠血清Cr和BUN水平。

1.4 腎臟組織病理學(xué)檢測(cè)

取各組小鼠右腎，4%多聚甲醛固定，包埋切片后進(jìn)行HE染色。用Leica DMi8顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）觀察腎組織的形態(tài)變化（×400）。對(duì)腎臟病理?yè)p傷程度進(jìn)行盲法評(píng)分，AKI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分5個(gè)等級(jí)：0分，正常腎組織；1分，腎小管受損范圍＜25%；2分，腎小管受損范圍25%～＜50%；3分，腎小管受損范圍50%～＜75%；4分，腎小管受損范圍≥75%。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α和IL-6水平

LPS處理24 h后處死小鼠，通過(guò)心腔取血，2 000 r/min下離心20 min后取上清液，根據(jù)試劑盒的操作說(shuō)明，采用ELISA法檢測(cè)各組血清中TNF-α和IL-6的水平。

1.6 ELISA法檢測(cè)腎組織MDA和SOD的濃度

取各組小鼠左腎，用RIPA裂解液裂解勻漿，12 000 r/min下離心15 min后取上清液，根據(jù)試劑盒的操作說(shuō)明，采用ELISA法檢測(cè)各組腎組織中MDA和SOD的濃度。

1.7 免疫組化方法檢測(cè)Nrf2

取各組小鼠右腎，4%多聚甲醛固定，包埋切片后，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)后沖洗，封閉，一抗用Nrf2抗體稀釋液（1 ∶150），二抗用生物素化羊抗兔IgG，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。Leica DMi8光學(xué)顯微鏡下觀察Nrf2在腎組織的表達(dá)（×400）。

1.8 Western blotting檢測(cè)Nrf2

取各組小鼠左腎組織，經(jīng)裂解、勻漿、離心后，提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，依次進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入洗膜緩沖液洗膜，加Nrf2抗體稀釋液（1 ∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，緩沖液沖洗后加入二抗室溫下孵育，使用免疫印跡化學(xué)發(fā)光法顯色，最后應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。結(jié)果以表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的烏司他丁對(duì)LPS刺激小鼠腎功能的影響

與對(duì)照組比較，LPS組小鼠血清Cr和BUN水平明顯升高（P＜ 0.05）。與LPS組比較，LPS+5 000 U/kg烏司他丁組和LPS+50 000 U/kg烏司他丁組小鼠血清Cr和BUN水平明顯降低（P＜ 0.05）。但LPS+5 000 U/kg烏司他丁組與LPS+50 000 U/kg烏司他丁組比較，血清Cr和BUN水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。見圖1。

2.2 不同劑量的烏司他丁對(duì)LPS刺激小鼠AKI腎組織損傷的影響

圖1 各組小鼠血清中Cr和BUN的水平Fig.1 Levels of creatinine and blood urea nitrogen in the serum of mice in each group

對(duì)照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整。LPS組小鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹或脫落，間質(zhì)水腫，腎小管明顯擴(kuò)張，腎損傷評(píng)分明顯增加（P＜ 0.05）。與LPS組比較，LPS+5 000 U/kg烏司他丁和LPS+50 000 U/kg烏司他丁組腎損傷程度明顯改善，腎損傷評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。但LPS+5 000 U/kg烏司他丁組與LPS+50 000 U/kg烏司他丁組比較，腎損傷評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見圖2。

2.3 不同劑量的烏司他丁對(duì)LPS刺激小鼠血清炎性因子水平的影響

圖2 各組小鼠腎組織HE染色Fig.2 Hematoxylin-eosin staining of the renal tissues of mice in each group

與對(duì)照組比較，LPS組小鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯升高（P＜ 0.05）。與LPS組比較，LPS+5 000 U/kg烏司他丁和LPS+50 000 U/kg烏司他丁組小鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯降低（P＜ 0.05）。且LPS+50 000 U/kg烏司他丁組TNF-α和IL-6水平較LPS+5 000 U/kg烏司他丁組進(jìn)一步降低（P＜ 0.05），說(shuō)明烏司他丁的抗炎作用呈一定劑量依賴性。見圖3。

2.4 不同劑量的烏司他丁對(duì)LPS刺激小鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷的影響

與對(duì)照組比較，LPS組小鼠腎組織中MDA濃度明顯升高，SOD濃度明顯下降（均P＜ 0.05）。與LPS組比較，LPS+5 000 U/kg烏司他丁組和LPS+50 000 U/kg烏司他丁組腎組織中MDA濃度明顯降低，SOD濃度明顯升高（均P＜ 0.05）。且LPS+50 000 U/kg烏司他丁組腎組織中MDA濃度較LPS+5 000 U/kg烏司他丁組進(jìn)一步降低，SOD濃度進(jìn)一步升高（均P＜0.05），說(shuō)明烏司他丁改善AKI時(shí)氧化應(yīng)激損傷的作用呈一定劑量依賴性。見圖4。

2.5 不同劑量的烏司他丁對(duì)LPS刺激小鼠AKI腎組織中Nrf2表達(dá)水平的影響

圖3 各組小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平Fig.3 Levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in the serum of mice in each group

圖4 各組小鼠腎組織中MDA和SOD的濃度Fig.4 Concentrations of malondialdehyde and superoxide dismutase in the renal tissues of mice in each group

與對(duì)照組比較，LPS組小鼠腎組織中Nrf2表達(dá)水平升高（P＜ 0.05）。與LPS組比較，LPS+5 000 U/kg烏司他丁組和LPS+50 000 U/kg烏司他丁組腎組織中Nrf2表達(dá)水平明顯升高（P＜ 0.05）。且LPS+50 000 U/kg烏司他丁組較LPS+5000 U/kg烏司他丁組Nrf2表達(dá)水平進(jìn)一步升高（P＜ 0.05），說(shuō)明烏司他丁增加AKI時(shí)Nrf2的表達(dá)水平呈一定劑量依賴性。見圖5。

3 討論

圖5 免疫組化染色和Western blotting檢測(cè)各組小鼠腎組織中Nrf2的表達(dá)Fig.5 Expression of Nrf2 detected by immunohistochemical staining and Western blotting in the renal tissues of mice in each group

目前，膿毒癥導(dǎo)致的AKI仍是危重癥領(lǐng)域的常見疾病，一旦合并AKI，膿毒癥患者的死亡率將增加6～8倍［3］。近年研究［3，10］發(fā)現(xiàn)，過(guò)度的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷在其病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。體外研究［11］已證實(shí)，氧化應(yīng)激和線粒體呼吸鏈功能異常在膿毒癥相關(guān)的AKI中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

近年來(lái)，Nrf2相關(guān)通路受到廣泛關(guān)注，其在氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Nrf2的激活可誘導(dǎo)其下游多種抗氧化酶的表達(dá)，從而參與機(jī)體的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。Nrf2已被發(fā)現(xiàn)在多種與氧化應(yīng)激有關(guān)疾病（如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤、急性肺損傷、肝臟缺血再灌注損傷）的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。近期也有研究［12］發(fā)現(xiàn)，Nrf2在膿毒癥引起的AKI中有保護(hù)作用。

烏司他丁作為臨床抑制機(jī)體內(nèi)蛋白酶活性的藥物，被廣泛用于急重型胰腺炎、膿毒癥及多器官功能障礙等危重癥的救治。近期有研究［13］對(duì)106例膿毒癥AKI患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)烏司他丁聯(lián)合持續(xù)血液凈化治療可明顯降低患者血漿中TNF-α、IL-6等炎性因子水平，降低C反應(yīng)蛋白和降鈣素原，減少氧化應(yīng)激損傷和改善腎功能。還有研究［7］發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可減少心臟手術(shù)后AKI的發(fā)生。體外實(shí)驗(yàn)［14］發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可通過(guò)激活Nrf2來(lái)減輕LPS引起的小鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。且動(dòng)物試驗(yàn)［15］發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可減少冷缺血再灌注AKI的炎性因子水平和氧化應(yīng)激產(chǎn)物。所以，本研究探討了不同劑量的烏司他丁是否可通過(guò)Nrf2抑制膿毒癥AKI小鼠的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。

通過(guò)HE染色和血清Cr、BUN的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可改善LPS刺激小鼠引起的AKI，不同劑量的烏司他丁并無(wú)明顯差異。但高劑量烏司他丁對(duì)全身炎性因子水平（血清TNF-α和IL-6）和腎組織中氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)（MDA和SOD）的改善作用優(yōu)于低劑量烏司他丁，且高劑量組Nrf2的表達(dá)水平也明顯高于低劑量組，說(shuō)明烏司他丁的抗炎和抗氧化應(yīng)激作用呈一定程度的劑量依賴性，這為臨床大劑量應(yīng)用烏司他丁提供了研究依據(jù)。

綜上所述，烏司他丁可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)LPS刺激引起的AKI，且烏司他丁的抗氧化應(yīng)激和抗炎作用呈一定程度的劑量依賴性。烏司他丁的保護(hù)作用可能與激活Nrf2的表達(dá)有關(guān)。本研究并未直接證實(shí)Nrf2參與其中，需要今后進(jìn)一步的深入研究。