粉塵螨過(guò)敏原Der f 35的克隆表達(dá)及免疫學(xué)鑒定

陳 揚(yáng)，陳獻(xiàn)雄，歐陽(yáng)春艷，鐘永浩，劉曉宇

深圳大學(xué)過(guò)敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳 518060

塵螨是最強(qiáng)烈的室內(nèi)過(guò)敏原之一，主要包括屋塵螨、粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)及埋內(nèi)歐螨等，其螨體和排泄物均能引起Ⅰ型超敏反應(yīng)，如過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性哮喘及過(guò)敏性皮炎等多種變態(tài)反應(yīng)性疾病[1-4]．研究表明，全球約有10%～20%的人對(duì)塵螨過(guò)敏，且50%以上的Ⅰ型超敏反應(yīng)由塵螨引起，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量[5]．文獻(xiàn)[6]研究顯示，在過(guò)敏性患者中粉塵螨過(guò)敏原Der f 35與免疫球蛋白E的結(jié)合率高達(dá)77.5%.而中國(guó)尚未見(jiàn)Derf35基因克隆、表達(dá)、純化及過(guò)敏原性鑒定的報(bào)道．本研究通過(guò)克隆、表達(dá)Derf35基因，并對(duì)得到的Der f 35重組蛋白進(jìn)行純化和反應(yīng)原性鑒定，為過(guò)敏性疾病患者的特異性診斷及治療提供基礎(chǔ)，具有重要的臨床意義.

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的粉塵螨由深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院過(guò)敏與免疫研究所純培養(yǎng)．感受態(tài)細(xì)胞為Rosetta(DE3)，表達(dá)載體為pET-32a． 塵螨過(guò)敏原血清取自深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院．

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑

核酸電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra)、純化儀(NGC Quest 10)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增儀(CFX96 Touch)、電泳槽(Mini-PROTEAN)、高壓電泳儀(Power pack)和紫外凝膠成像儀(Gel Doc XR+)均購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan GO)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；恒溫恒濕箱ZXMP-A1151購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；塵螨核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)提取試劑盒 Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒Omega購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；Taq 酶、T4脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)酶和膠回收試劑盒均購(gòu)自日本 Takara公司；Ni柱購(gòu)自美國(guó)GE公司．

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 粉塵螨總RNA的提取

取純培養(yǎng)的粉塵螨用液氮浸泡，研磨后用RNA提取試劑盒Trizol提取粉塵螨總RNA．

2.2 粉塵螨重組過(guò)敏原Der f 35基因的擴(kuò)增

以獲得的總RNA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成DNA．依據(jù)已知的Derf35序列設(shè)計(jì)上游引物為5′-GGATCC ATGATCAAATTTTTGTGCAT-3′，下游引物為5′-CTCGAGTTAATCGGCGATTTCACCA-3′．然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增．

2.3 構(gòu)建粉塵螨重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒

將Derf35基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，連接構(gòu)建pET-32a-Derf35載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)克隆菌TOP10菌株中，涂布至含50 μg/mL的氨芐霉素平板上，于37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜．次日挑選陽(yáng)性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，取1 mL菌液送往上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序．將測(cè)序正確的質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pET-32a用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，將得到的Derf35基因片段與pET-32a酶切產(chǎn)物連接，構(gòu)建pET-32a(+)-Derf35重組質(zhì)粒．將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)中用于誘導(dǎo)表達(dá)．

2.4 誘導(dǎo)表達(dá)粉塵螨重組蛋白

少量表達(dá)粉塵螨重組蛋白的具體操作為：① 取20 μL含有Derf35的克隆菌菌液加入到20 mL的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)液(含100 μg/mL氨芐青霉素)中，于37 ℃、150 r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；② 取培養(yǎng)后的菌液1 mL加入到20 mL新滅菌的LB培養(yǎng)液中，再加入20 μL氨芐青霉素，于37 ℃、150 r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)4 h；③ 待細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即光密度值D(600)為 0.6～0.9時(shí)，加入20 μL的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，分別于37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)4 h，16 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)20 h，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；④ 收集沉淀超聲破碎，取樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳鑒定表達(dá)情況．

大量表達(dá)粉塵螨重組蛋白的具體操作為：取50 μL含Derf35的克隆菌菌液加入到50 mL的LB培養(yǎng)液(含100 μg/mL氨芐青霉素)中，于37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)過(guò)夜，取50 mL菌液加入到1 L的LB培養(yǎng)液(含100 μg/mL氨芐青霉素)中，于37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)4 h后，加入IPTG高溫(37 ℃)誘導(dǎo)4 h，離心收集沉淀．

2.5 粉塵螨重組蛋白pET-32a-Der f 35的純化

粉塵螨重組蛋白pET-32a-Der f 35的純化步驟為：① 將離心收集的含Derf35基因的克隆菌菌體用6 mol的鹽酸胍重懸超聲破碎，離心取上清液；② 用5倍體積柱平衡緩沖液(由50 mmol/L Tris、 200 mmol/L NaCl和4 mol/L尿素配制)預(yù)平衡Ni-NTA 柱，取上清液清上樣；③ 上樣完畢后，用10倍體積柱體積的平衡緩沖液(由50 mmol/L Tris、 200 mmol/L NaCl和4 mol/L尿素配制)洗滌； ④ 再用10倍體積柱體積的洗滌液(由50 mmol/L Tris、 150 mmol/L NaCl、 4 mol/L尿素和40 mmol/L咪唑配制)洗滌；⑤ 用洗脫液(由50 mmol/L Tris、 200 mmol/L NaCl、 4 mol/L尿素和300 mmol/L咪唑配制)將目的蛋白洗脫、收集；⑥ 將純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析．

2.6 免疫印跡及免疫原性分析

對(duì)純化后的pET-32a-Der f 35重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，進(jìn)行免疫印跡(western blot)分析．使用含50 g/L脫脂奶粉的TBST(tris buffeered saline with Tween-20)緩沖液室溫封閉2 h后，再用含25 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液對(duì)塵螨過(guò)敏患者的陽(yáng)性血清進(jìn)行稀釋(體積比為10∶1)，4 ℃孵育過(guò)夜．回收血清后，用TBST緩沖洗滌3次，稀釋偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶鼠抗人IgE作為二抗孵育1.5 h后，用TBST緩沖液洗滌3次．多功能化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)粉塵螨重組蛋白pET-32a(+)-Der f 35免疫原性．

3 結(jié)果與分析

3.1 粉塵螨過(guò)敏原Der f 35基因的構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI對(duì)pET-32a-Derf35重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)質(zhì)量濃度為20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1，在500堿基對(duì)(base pair, bp)處附近可見(jiàn)目的基因片段，該基因與Derf35基因片段大小相符．

1為Der f 35基因片段；M為D10000 bp DNA分子標(biāo)記圖1 pET-32a-Der f 35重組質(zhì)粒 BamH I和Xho I雙酶切鑒定Fig.1 Identification of pET-32a-Der f 35 through double enzyme digestion by BamH I and Xho I

3.2 粉塵螨重組蛋白的表達(dá)及純化

將含有PET-32a-Derf35重組質(zhì)粒的Rosetta感受態(tài)細(xì)胞置于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在16 ℃和37 ℃兩種條件下誘導(dǎo)其表達(dá)目的蛋白，結(jié)果如圖2．由圖2(a)可見(jiàn)，在37 ℃時(shí)Der f 35重組蛋白誘導(dǎo)量較多，且為包涵體．由圖2(b)可見(jiàn)，37 ℃誘導(dǎo)條件下Der f 35大量表達(dá)，純化后可得到純度較高的pET-32a-Der f 35重組蛋白．

M為DB170-10蛋白分子量標(biāo)記；1為誘導(dǎo)前克隆菌菌液；2為16 ℃誘導(dǎo)后的上清液；3為16 ℃誘導(dǎo)后的沉淀；4為37 ℃誘導(dǎo)后的上清液；5為37 ℃誘導(dǎo)后的沉淀； 7為Der f 35重組蛋白圖2 重組蛋白Der f 35的表達(dá)和純化Fig.2 Expression and purification of recombinant protein Der f 35

3.3 粉塵螨重組蛋白免疫原性的鑒定

將重組蛋白pET-32a-Der f 35轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取10份塵螨陽(yáng)性患者血清進(jìn)行一抗實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3，表明重組蛋白Der f 35具有免疫原性．

3.4 粉塵螨過(guò)敏原Der f 35的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將Der f 35氨基酸序列輸入美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Coalition Building Institute, NCBI)進(jìn)行Blast比對(duì)分析，并將同源序列以Fasta格式保存．使用MEGA7軟件分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖4．由圖4可見(jiàn)， 粉塵螨與屋塵螨、 熱帶無(wú)爪螨、 害嗜鱗螨、 綿羊癢螨和免耳癢螨的親緣關(guān)系比較近．

圖3 Der f 35蛋白與過(guò)敏性疾病患者的血清結(jié)合Fig.3 Binding of Der f 35 to serum from patients with allergic diseases

3.5 粉塵螨Der f 35蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將Der f 35的氨基酸序列輸入Protean網(wǎng)站進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5．圖5顯示，Derf35基因編碼的氨基酸序列由2個(gè)α螺旋、6個(gè)β折疊、2個(gè)β轉(zhuǎn)角和10個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲片段組成，還含有1個(gè)潛在的T細(xì)胞抗原表位．

圖4 Der f 35的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of Der f 35

圖5 Der f 35蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of Der f 35 protein

4 討論

目前，塵螨過(guò)敏疾病的臨床診斷主要依賴免疫學(xué)檢測(cè)，而針對(duì)塵螨過(guò)敏疾病最常用且最有效的方法是特異性免疫治療(specific immunity，SIT)[7-9]．將微量塵螨過(guò)敏原通過(guò)舌下或口服給藥途徑進(jìn)行脫敏治療[10-11]，可減少過(guò)敏性休克的發(fā)生概率，再逐步增加塵螨過(guò)敏原的含量，從而達(dá)到提升塵螨過(guò)敏患者對(duì)特異性過(guò)敏原的免疫耐受能力，減輕或控制其過(guò)敏癥狀的治療目的．其中，舌下給藥脫敏是目前依從性最好的劑型．

但傳統(tǒng)塵螨過(guò)敏原為天然塵螨疫苗，即塵螨粗提取液，其成分復(fù)雜，含有多種過(guò)敏原，非過(guò)敏性或毒性蛋白及雜質(zhì)，且含量不穩(wěn)定，組分無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致安全性低且重復(fù)性差[12]．運(yùn)用塵螨粗提取液作為塵螨疫苗不僅治療周期長(zhǎng)，且副作用大，長(zhǎng)期使用易導(dǎo)致腫脹、紅暈、壞死或硬結(jié)等局部反應(yīng)，以及喉頭水腫、血管性水腫、全身紅斑、蕁麻疹、支氣管痙攣、哮喘甚至休克等全身反應(yīng)[13-14]．隨著塵螨相關(guān)的變態(tài)反應(yīng)疾病患病率逐漸上升，臨床對(duì)塵螨過(guò)敏的診斷和治療也提出了更高的要求．因此，新型塵螨疫苗(包括DNA疫苗、重組活菌疫苗、細(xì)菌性疫苗和重組蛋白疫苗)作為替代塵螨粗提取物的脫敏治療新方案，具有很好的應(yīng)用前景，其成分清晰且作用機(jī)理明確，有利于臨床進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的治療．重組蛋白疫苗是將目的抗原基因構(gòu)建于表達(dá)載體上再轉(zhuǎn)化至細(xì)菌、酵母、昆蟲或動(dòng)物細(xì)胞中，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)大量抗原蛋白再進(jìn)行純化所制備的疫苗，具有純度高、產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好，且安全性高的優(yōu)點(diǎn)[15]．

本研究提取了粉塵螨總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到Derf35基因，并將其連接至pET-32a表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)化到Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中；在一定條件下誘導(dǎo)該基因大量表達(dá)，純化得到大量目的蛋白，通過(guò)Western blot鑒定其免疫原性，得到塵螨Der f 35單一過(guò)敏原．有助于完善臨床上過(guò)敏性疾病的特異性診斷及塵螨疫苗的制備[16]，降低塵螨粗提取液帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，為臨床治療提供了基礎(chǔ)材料，也為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療打下基礎(chǔ)[17]．通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可以預(yù)測(cè)對(duì)人類具有同樣過(guò)敏原性的塵螨，找到親緣關(guān)系較近的塵螨并對(duì)其蛋白質(zhì)序列分析，進(jìn)而找到相對(duì)保守的氨基酸序列，輔助相對(duì)廣譜性的靶向藥物的開(kāi)發(fā)和研究．通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，可預(yù)測(cè)重組蛋白Der f 35的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要含有β折疊及無(wú)規(guī)則卷曲片段和潛在的T淋巴細(xì)胞抗原決定簇片段，為塵螨過(guò)敏性疾病的診斷提供理論依據(jù)．

結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)基因工程技術(shù)成功克隆、表達(dá)和純化出粉塵螨Derf35基因和蛋白Der f 35，且Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Der f 35具有較強(qiáng)過(guò)敏原性，是一種新過(guò)敏原．研究結(jié)果可為塵螨過(guò)敏性疾病診斷及新型過(guò)敏原疫苗研制提供理論依據(jù)．

致謝:衷心感謝深圳大學(xué)劉志剛教授的悉心指導(dǎo)！