參麥注射液通過下調(diào)miR-106a保護腎小管上皮細胞NRK-52E缺氧-復(fù)氧損傷的分子機制

黃真珍，王培琦，李 冰，李曉媛

0 引 言

腎缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是外傷、手術(shù)切除和腎移植過程中的常見問題，長時間的缺血導(dǎo)致不可逆的腎損害[1]。I/R損傷的發(fā)病機制涉及細胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激、微循環(huán)障礙等多種病理過程，其中細胞凋亡導(dǎo)致的腎小管上皮細胞功能喪失在腎I/R損傷中起重要作用[2]。因此，如何有效預(yù)防腎小管上皮細胞凋亡對防治腎I/R意義重大。參麥注射液是由麥冬提取物和紅參提取物組成的重要方劑，具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津之功效，廣泛用于治療心功能障礙[3]。研究發(fā)現(xiàn)，參麥注射液通過調(diào)控能量代謝途徑能夠抑制I/R誘導(dǎo)的異常心肌細胞凋亡在缺血性心肌病中具有保護作用[4-5]。微小RNA(microRNA，miR)-106a為miR-106a-363基因簇的成熟體miRNA，研究顯示miR-106a在大鼠腎I/R損傷時表達上調(diào)，是評價急性腎損傷的潛在標志物[6]。PI3K/AKT通路參與調(diào)控細胞代謝、生長、增殖、凋亡等多種細胞過程，與腎I/R損傷的發(fā)生密切相關(guān)[7]。本研究通過構(gòu)建缺氧復(fù)氧模型模擬I/R損傷，觀察參麥注射液對腎小管上皮細胞NRK-52E增殖、凋亡的影響，并以miR-106a、PI3K/AKT通路為切入點探討其保護機制，以期為參麥注射液用于腎I/R損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E購于武漢普諾賽生命科技公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Hyclone公司；miR-106a模擬物(miR-106a mimics)及其陰性對照(miR-NC)、抑制物(anti-miR-106a)及其陰性對照(anti-NC)、PCR引物由上海生工公司提供；LipofectamineTM2000、放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、Trizol試劑、microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司；參麥注射液購于杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司；細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)試劑盒、購于北京索萊寶生物科技公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氫光熒光素(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物技術(shù)公司；兔源Ki67抗體、兔源裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)抗體、兔源磷酸化的磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphorylated Phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，p-PI3K)、兔源磷酸化的蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B，p-AKT)、兔源β-actin抗體、羊抗兔二抗購于上海艾博抗生物技術(shù)公司。SYBR green master mix購于北京天根生化科技公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)染取2×105個對數(shù)期NRK-52E細胞接種6孔板，待細胞融合度達到50%時進行細胞轉(zhuǎn)染。首先取50 pmol的待轉(zhuǎn)染物與適量無血清DMEM培養(yǎng)基混勻，使終體積為25 μL，記為混合物1。取1 μL的LipofectamineTM2000與24 μL無血清DMEM培養(yǎng)基混勻，記為混合物2。靜置5 min后，將1與2混合，記為混合物3。室溫靜置15 min。將混合物3加入到融合度約為50%的NRK-52E細胞，6 h后更換含血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2體外缺氧-復(fù)氧模型制備參考文獻[8]方法制備缺氧-復(fù)氧模型，將NRK-52E細胞培養(yǎng)瓶至于37℃，含1%O2、5% CO2、94% N2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，模擬缺氧后，再置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h終止實驗。

1.2.3細胞培養(yǎng)和分組NRK-52E細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、CO2體積分數(shù)5 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到30%時，加入胰酶消化，按照1∶4比例傳代。取第5代細胞進行實驗。用含不同濃度(0.1、0.5、2.5 μmol/L)參麥注射液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min(37 ℃，5% CO2)后進行體外缺氧-復(fù)氧(6 h/24 h)實驗；非參麥注射液干預(yù)組繼續(xù)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 min(37℃，5% CO2)，CCK-8法檢測顯示參麥注射液以濃度依賴方式增加NRK-52E細胞活力，后續(xù)選擇2.5 μmol/L參麥注射液進行實驗。實驗分為正常對照組、I/R組、參麥+I/R組，缺氧-復(fù)氧6 h/24 h時收集細胞用于后續(xù)檢測。miR-NC、miR-106a mimics、anti-miR-NC、anti-miR-106a轉(zhuǎn)染至NRK-52E細胞后，進行缺氧復(fù)氧處理，記為miR-NC+I/R組、miR-106a+I/R組、anti-miR-NC+I/R組、anti-miR-106a+I/R。miR-NC、miR-106a mimics分別轉(zhuǎn)染至NRK-52E細胞中用2.5 μmol/L參麥注射液處理30 min，而后進行缺氧復(fù)氧處理，記為參麥+miR-NC+I/R組、參麥+miR-106a+I/R組，缺氧-復(fù)氧6 h/24 h時收集細胞用于后續(xù)檢測。

1.2.4CCK-8法檢測細胞活力收集各組細胞，制備單細胞懸液，按照5×103個/孔接種96孔板，貼壁后，每孔添加10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h?？瞻卓渍{(diào)零后，酶標儀檢測450 nm處各孔的光密度(A)值。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集各組細胞，用1×上樣緩沖液制備濃度為1×105個/mL的單細胞懸液。取500 μL細胞懸液，分加入5 μL的Annexin V-FITC，5 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，避光孵育15 min混勻，上機檢測各組細胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測Ki67和Cleaved-caspase-3蛋白表達收集各組細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白。按照二喹啉甲酸試劑盒說明書進行蛋白定量。蛋白樣品與上樣緩沖液混合變性后，取30 μg上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后，采用常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜方法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h，洗膜后加入1∶500稀釋的Cleaved-caspase-3一抗、1∶500稀釋Ki67一抗的溶液4 ℃封閉過夜；再次洗膜后加入1∶2000稀釋的二抗室溫孵育膜1 h。洗膜后，進行化學發(fā)光顯色，凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描分析各目的條帶灰度值。以目的蛋白和內(nèi)參β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.2.7實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-106a表達水平使用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為擴增模板，利用SYBR green master mix配置20 μL反應(yīng)體系，進行RT-qPCR擴增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt方法分析miR-106a的相對表達水平。miR-106a上游引物5＇-GCGGCGGAAAAGTGCTTACAGTG-3＇，下游引物5＇-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3＇；U6上游引物5＇-GTGCTCGCTTC GGCAGCACATATAC-3＇，下游引物5＇-AAAAATATGGAACGCTCACGAATTTG-3＇。

2 結(jié) 果

2.1參麥注射液對腎小管上皮細胞NRK-52E凋亡的影響與正常對照組比較，I/R組NRK-52E細胞活力、Ki67蛋白表達顯著降低，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，參麥+I/R組NRK-52E細胞活力、Ki67蛋白表達顯著升高，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

2.2參麥注射液對miR-106a表達的影響I/R組NRK-52E細胞miR-106a的表達水平(3.27±0.25)較正常對照組(1.00±0.08)和參麥+I/R組(1.53±0.08)顯著降低(P<0.05)。

2.3miR-106a對腎小管上皮細胞NRK-52E活性和凋亡的影響與miR-NC+I/R組比較，miR-106a+I/R組NRK-52E細胞miR-106a的表達水平顯著升高，細胞活性、Ki67蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與anti-miR-NC+I/R組比較，anti-miR-106a+I/R組NRK-52E細胞miR-106a的表達水平顯著降低，細胞活性、Ki67蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表2，圖2。

1：正常對照組； 2：I/R組； 3：參麥+I/R組

表 1 參麥注射液對腎小管上皮細胞NRK-52E活性和凋亡的影響

1:miR-NC+I/R組; 2:miR-106a+I/R組; 3:anti-miR-NC+I/R組; 4:anti-miR-106a+I/R組

表 2 miR-106a對腎小管上皮細胞NRK-52E活性和凋亡的影響

2.4上調(diào)miR-106a可以逆轉(zhuǎn)參麥注射液對腎小管上皮細胞NRK-52EI/R損傷的影響與參麥+miR-NC+I/R組比較，參麥+miR-106a+I/R組NRK-52E細胞miR-106a表達顯著升高，細胞活性、Ki67蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表3，圖3。

表 3 miR-106a逆轉(zhuǎn)參麥注射液對腎小管上皮細胞NRK-52EI/R損傷的影響

1:參麥+miR-NC+I/R組; 2:參麥+miR-106a+I/R組

2.5PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達與正常對照組比較，I/R組NRK-52E細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，參麥+I/R組NRK-52E細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與參麥+miR-NC+I/R組比較，參麥+miR-106a+I/R組NRK-52E細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見表4，圖4。

1:正常對照組; 2:I/R組; 3:參麥+I/R組; 4:參麥+miR-NC+I/R組; 5:參麥+miR-106a+I/R組

表 4 PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達

3 討 論

參麥注射液對是國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的一種中藥注射劑，具有改善微循環(huán)、抗凝、修復(fù)保護心肌細胞以及化療增效減毒作用，廣泛應(yīng)用于休克、擴張型冠心病、慢性肺心病、病毒性心肌炎和癌癥的治療[9-11]。研究顯示，參麥和丹參注射液聯(lián)用能夠抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放，保護心肌細胞免受缺氧/復(fù)氧和過氧化氫誘導(dǎo)的損傷[12]。參麥注射液可抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)的活化，提高B細胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)與Bcl相關(guān)X蛋白(Bcl-associated X protein，Bax)的比值阻止細胞凋亡，從而保護腸I/R時所致的肺損傷[13]。本研究利用缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞NRK-52E損傷模型，探討丹參注射液對腎小管上皮細胞IR損傷的影響機制。缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)后NRK-52E細胞活力減弱，凋亡增加，Cleaved-caspase-3表達增加，Ki67表達降低。Cleaved-caspase-3是細胞凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的活化形式，其激活將引起不可逆的細胞凋亡[14]。Ki67是維持細胞增殖的核蛋白，其表達水平是反應(yīng)細胞增殖能力的重要指標[15]。參麥注射液處理可部分恢復(fù)NRK-52E細胞活力和Ki67表達，降低Cleaved-caspase-3表達和細胞凋亡率，說明參麥注射液能夠減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的NRK-52E細胞損傷。

miR-106a是一種內(nèi)源性非編碼RNA，其通過靶向下游靶mRNA發(fā)揮翻譯抑制作用，已被證實與多種腎疾病有關(guān)。研究顯示，腎細胞癌患者中血清中miR-106a水平升高，術(shù)后血清miR-106a水平降低，是腎細胞癌診斷潛在分子標志物[16]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞中miR-106a表達上調(diào)，抑制miR-106a通過靶向血小板反應(yīng)蛋白2(hrombospondin 2，THBS2)可減輕LPS誘導(dǎo)的細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)后NRK-52E細胞miR-106a表達水平升高，而參麥注射液處理可降低miR-106a表達水平，提示參麥注射液對NRK-52E細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用可能是通過下調(diào)miR-106a表達實現(xiàn)的。進一步研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-106a表達可提高細胞活力，抑制細胞凋亡，減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)NRK-52E細胞損傷，而上調(diào)miR-106a表達則降低細胞活力，促進細胞凋亡，加劇缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)NRK-52E細胞損傷。此外，上調(diào)miR-106a還可逆轉(zhuǎn)參麥注射液對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)NRK-52E細胞活力和凋亡的影響，這進一步說明參麥注射液對NRK-52E細胞缺氧復(fù)氧損傷的保護作用與下調(diào)miR-106a表達有關(guān)。

有報道稱，PI3K/AKT通路激活可抑制炎癥因子釋放，降低腎組織氧化應(yīng)激水平，減少腎小管細胞凋亡，是改善腎I/R損傷的潛在靶點[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)后NRK-52E細胞PI3K/AKT通路受到抑制，而參麥注射液處理可激活PI3K/Akt通路，上調(diào)miR-106a可逆轉(zhuǎn)參麥注射液對PI3K/Akt通路的影響，說明參麥注射液可能通過下調(diào)miR-106a表達激活PI3K/AKT信號通路進而保護NRK-52E細胞缺氧復(fù)氧損傷。

綜上所述，參麥注射液可促進腎小管上皮細胞增殖，抑制細胞凋亡，保護缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的細胞損傷，其機制可能與抑制miR-106a表達進而激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)，這為參麥注射液用于防治腎I/R損傷奠定了理論基礎(chǔ)。