PCR技術(shù)在新冠病毒核酸檢測中的應(yīng)用

張禮堃，鄒秉杰綜述，宋沁馨，周國華綜述

0 引 言

新型冠狀病毒 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是一種單鏈正股RNA病毒，屬于冠狀病毒科，β病毒屬(Betacoronavirus)[1]。SARS-CoV-2可以發(fā)生人際傳播，且傳播能力強(qiáng)于2003年出現(xiàn)的SARS-CoV[2]。其主要傳播方式主要為接觸傳播和飛沫傳播[3-4]。人體感染新型冠狀病毒后，輕癥患者會出現(xiàn)以發(fā)熱、干咳為主的癥狀，重癥患者多在發(fā)病1周后出現(xiàn)呼吸困難和(或)低氧血癥，甚至發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征及多器官功能衰竭等[5]。由于SARS-CoV-2的強(qiáng)傳染性和致死性，使用快速、準(zhǔn)確、便利的診斷方法對其進(jìn)行檢測是發(fā)現(xiàn)傳染源、阻斷疾病傳播鏈進(jìn)而防控疫情的關(guān)鍵。

常用的病原體檢測方法有病原體培養(yǎng)、血清抗體檢測、核酸檢測等，其中病毒培養(yǎng)檢測耗時數(shù)天，效率過低；血清抗體檢測特異性較低[6]。因此臨床上最普遍的檢測手段是時間更短、特異性更強(qiáng)、靈敏度更高的核酸檢測方法。目前已有多種SARS-CoV-2的核酸檢測方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增、CRISPR/Cas系統(tǒng)等[7-10]。其中PCR技術(shù)是最早發(fā)展起來的核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過高溫變性、低溫退火、引物延伸的多次循環(huán)可將靶標(biāo)擴(kuò)增上萬甚至上億倍。作為一種相對成熟的核酸擴(kuò)增技術(shù)，PCR技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的多個領(lǐng)域[11-13]。

本綜述對目前基于PCR原理檢測SARS-CoV-2的方法進(jìn)行了總結(jié)和展望。

1 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, rt-qPCR)

實時熒光定量PCR屬于第二代PCR技術(shù)，可以對核酸進(jìn)行定量檢測。該方法利用核酸擴(kuò)增時產(chǎn)生的擴(kuò)增曲線來對其初始濃度進(jìn)行定量計算，目前主要的方法包括熒光染料法和TaqMan探針法。

1.1rt-qPCR檢測SARS-CoV-2的原理熒光染料法的原理是：在反應(yīng)體系中加入一種可以與雙鏈核酸非特異性結(jié)合的熒光染料，每一輪循環(huán)結(jié)束時染料就會結(jié)合在擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈核酸上，并產(chǎn)生熒光。根據(jù)熒光信號達(dá)到預(yù)定熒光閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)就可判斷目標(biāo)核酸分子的有無。

TaqMan探針法的原理是：在反應(yīng)體系中加入一種可以與靶標(biāo)特異性結(jié)合的寡核苷酸探針，其兩端分別連接熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，二者共存時由于熒光能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，無熒光產(chǎn)生。在引物延伸的過程中，具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶會將探針5’端的熒光基團(tuán)切割下來，從而產(chǎn)生熒光。根據(jù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，可判斷靶標(biāo)分子的有無。

SARS-CoV-2的遺傳物質(zhì)是單鏈RNA，其核酸檢測過程包括逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個步驟。首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，病毒RNA被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后DNA聚合酶再對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)樣本擴(kuò)增曲線的Ct值，即可判斷樣本中是否含有SARS-CoV-2核酸。我國國家衛(wèi)建委推薦的標(biāo)準(zhǔn)是：Ct值<37，可報告為陽性；無Ct值或Ct≥40，為陰性；Ct值在37～40，則重復(fù)實驗。

1.2rt-qPCR在新冠檢測中的應(yīng)用rt-qPCR是WHO、中國國家衛(wèi)生健康委員會等單位推薦的新冠肺炎確診的標(biāo)準(zhǔn)之一。但是，從大規(guī)模的檢測結(jié)果來看，rt-qPCR具有“假陰性”問題，其陽性檢出率僅為30%?！凹訇幮浴钡囊粋€重要原因是待測樣本中病毒載量低于常規(guī)rt-qPCR檢測限，因此，提高rt-qPCR的靈敏度非常關(guān)鍵。

選擇新的擴(kuò)增位點(diǎn)，并設(shè)計新的引物可以提高rt-qPCR的檢出率。目前常見的目標(biāo)序列包括非結(jié)構(gòu)基因orf1a、nsp-12(RdRp)、nsp-13(Helicase)、orf1b等，以及結(jié)構(gòu)基因E gene、S gene、N gene等[14]。SARS-CoV-2PCR的檢測靶標(biāo)通常包含一個非結(jié)構(gòu)基因和一個結(jié)構(gòu)基因，其中結(jié)構(gòu)基因E gene、S gene等用來做篩選檢測，而非結(jié)構(gòu)基因orf1a、orf1b等用來做驗證檢測[7]。例如，Corman等[15]設(shè)計了針對RdRP、E和N基因的三重PCR檢測方法，其結(jié)果顯示RdRP基因檢測的靈敏度最高(3.8 copies/reaction)。但在檢測多種臨床樣本時，該方法的陽性檢出率不高(28.2%)。為了提高檢出率，Chan等[16]設(shè)計了針對RdRp/Hel、S和N基因的檢測方法，相比于檢測RdRP、E gene和N gene，該方法的檢出率顯著提高。但是，SARS-CoV-2在復(fù)制過程中易發(fā)生變異，這往往會降低PCR檢測的準(zhǔn)確性。為了找到SARS-CoV-2高度保守的序列以提高檢測準(zhǔn)確性，Yip等[17]分析了SARS-CoV-2基因組，發(fā)現(xiàn)nsp-2基因符合保守性和病毒特異性要求，并首次以nsp-2基因為靶標(biāo)檢測SARS-CoV-2。該方法在保證特異性及與Chan的方法相同靈敏度的同時，還縮短了檢測時間，1 h即可出結(jié)果。

rt-qPCR可以滿足SARS-CoV-2常規(guī)篩查的需求，但對于病毒載量較低的樣本(如康復(fù)期患者)，其檢出率并不能令人滿意。因此臨床上還需要靈敏度更高的方法針對這些特定樣本進(jìn)行檢測。

2 微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)

ddPCR是Kinzler和Vogelstein于1999年提出的一種核酸定量檢測技術(shù)，屬于第三代PCR技術(shù)[12]。與第二代相比，ddPCR在靶標(biāo)的絕對定量檢測方面具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度[18-20]。目前，ddPCR已經(jīng)在腫瘤突變基因檢測、病原體檢測等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用[21-23]。

2.1ddPCR原理ddPCR通常包括樣本分散、擴(kuò)增、定量檢測3個過程[12]。首先將待測樣本送入儀器中微滴化處理，其中的靶標(biāo)被分散到數(shù)千乃至數(shù)萬個納升/皮升級的液滴中，每個液滴含有0或1條模板。若分散不均，某些液滴則包含兩條及以上的模板。隨后對所有液滴進(jìn)行PCR擴(kuò)增并檢測每個微滴的熒光信號。擴(kuò)增前含有1條及以上模板的微滴信號為“1”(陽性)，不含模板的微滴信號為“0”(陰性)。根據(jù)陽性微滴的比例和泊松分布原理可以計算得到樣品中初始目標(biāo)模板的拷貝數(shù)[24]。

2.2ddPCR相對于傳統(tǒng)qPCR的優(yōu)勢

2.2.1ddPCR具有高靈敏度與傳統(tǒng)的qPCR不同，ddPCR是通過對每一條模板“單分子擴(kuò)增”產(chǎn)生的信號進(jìn)行分析來實現(xiàn)定量的，因此其靈敏度有了明顯提升[25]。且樣本分散時產(chǎn)生的液滴越多，體積越小，ddPCR的檢測限越低，靈敏度越高。

2.2.2ddPCR對PCR抑制劑有更強(qiáng)的抵抗作用在提取待測核酸的過程中，往往會殘留一些原來樣本中的組分，如細(xì)菌的某些蛋白、多糖等，這類成分對PCR有一定抑制作用。相比于傳統(tǒng)的qPCR，ddPCR對這類抑制劑的抵抗作用更強(qiáng)。Dingle等[26]發(fā)現(xiàn)SDS和肝素對ddPCR的IC50高于qPCR，而EDTA對兩種方法的抑制作用類似。ddPCR有更強(qiáng)的抗性可能是因為在樣本分散過程中，抑制劑也被分散到各液滴中，成為“單分子”，相比于在完整體系中的反應(yīng)，其抑制作用被削弱。

2.2.3ddPCR不需要標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌穫鹘y(tǒng)qPCR在進(jìn)行核酸絕對定量檢測時，需要提前制備一系列梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品對質(zhì)量的要求極高，且檢測前需要配置梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)液，這樣就容易引入人為誤差[27]。另外，不同實驗室使用的對照品往往不同，從而造成實驗參考性、重復(fù)性差的問題。但ddPCR不需要標(biāo)準(zhǔn)品即可進(jìn)行絕對定量，從而有效避免了上述問題。

2.3ddPCR在SARS-CoV-2檢測方面的應(yīng)用SARS-CoV-2的傳播途徑主要是飛沫傳播和接觸傳播，但仍有氣溶膠傳播的可能性。Liu等[28]利用ddPCR對醫(yī)院等公共區(qū)域的空氣樣本進(jìn)行新冠核酸檢測后發(fā)現(xiàn)，在醫(yī)院，ICU內(nèi)的沉淀樣本、方艙醫(yī)院廁所的空氣樣本以及方艙醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員區(qū)的空氣樣本檢測呈陽性，其他區(qū)域幾乎檢測不到病毒核酸；在其他公共區(qū)域，發(fā)生過大規(guī)模人群聚集的區(qū)域病毒核酸濃度較高。這提示我們平時應(yīng)注意對潛在的含病毒氣溶膠的熱點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行徹底消殺、保持醫(yī)院通風(fēng)狀況良好并避免聚集。

新冠肺炎患者出院后發(fā)生的“復(fù)陽”現(xiàn)象引起了人們的關(guān)注。“復(fù)陽”現(xiàn)象的一個重要原因是康復(fù)期患者上呼吸道樣本的病毒載量過低，常規(guī)RT-PCR無法檢出[29-30]。Yu等[31]利用ddPCR對76位新冠肺炎患者的痰液、鼻拭子、咽拭子等樣本進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，癥狀明顯期的患者痰液的病毒載量顯著高于鼻咽拭子；而對于載量低于RT-PCR檢測限的康復(fù)期樣本，ddPCR仍可測出核酸拷貝數(shù)。此外，在RT-PCR測定為陰性的161例樣本中，ddPCR測出4例為陽性；而RT-PCR測定為單基因陽性的67例樣本中，ddPCR測出41例為陽性，這表明ddPCR能糾正RT-PCR檢測的結(jié)果。

目前美國的Bio-Rad、Gnomegen公司和法國的Stilla公司已經(jīng)開發(fā)出了基于ddPCR原理進(jìn)行新冠檢測的試劑盒，其中方法靈敏度最高的Gnomegen公司檢出限(LOD)可達(dá)0.17 copies/μL。但ddPCR檢測對儀器設(shè)備要求較高，操作復(fù)雜，檢測時間較長，這些問題限制了ddPCR在臨床上的應(yīng)用。因此，即時、快速、準(zhǔn)確的SARS-CoV-2檢測方法可以更好的滿足臨床的需求。

3 基于PCR的現(xiàn)場快速檢驗技術(shù)(point-of-care test，POCT)

POCT，又稱床旁檢測技術(shù)、即時檢測技術(shù)，是一種在采樣現(xiàn)場進(jìn)行的、利用便攜式分析儀器快速得到檢測結(jié)果的一種檢測方式[32]。在病原體檢測方面，相比于傳統(tǒng)的檢測方式，POCT具有檢測速度快、不受場地限制等優(yōu)點(diǎn)，因此在應(yīng)對大規(guī)模傳染病爆發(fā)時，POCT具有重要應(yīng)用價值[33-34]。目前美國的Mesa Biotech、Cephied公司，德國的QIAGEN公司，國內(nèi)的圣湘等公司已經(jīng)開發(fā)出了基于PCR原理的新冠POCT設(shè)備。其中Mesa Biotech和圣湘公司最快僅需30 min即可完成檢測。

在新冠肺炎檢測中，POCT不僅可以加快檢測速度，還可以避免檢測人員與患者的接觸、減低降低感染風(fēng)險。目前國內(nèi)新冠肺炎檢測的場所主要是醫(yī)院和第三方檢測機(jī)構(gòu)，檢測人員需要直接面對待測人員進(jìn)行取樣。盡管有防護(hù)措施，但直面患者取樣依然會增加檢測人員感染的風(fēng)險。因此很多機(jī)構(gòu)研發(fā)出了供人們在家取樣的試劑盒。Radbel等[35]在2020年5月初研發(fā)出一套用于唾液收集與檢測的方法，該方法允許患者在家收集唾液樣本。收集好樣本后，患者需要將樣本寄送到已受美國臨床實驗室改進(jìn)法案修正案(CLIA)認(rèn)證的實驗室中，進(jìn)行檢測。家庭采樣可以為患者的采樣提供便利，提高的檢測效率，還能減少人們?nèi)メt(yī)療機(jī)構(gòu)的次數(shù)，避免發(fā)生交叉感染。

POCT雖然可以提高SARS-CoV-2檢測效率，但一次只能檢測SARS-CoV-2一種病原體。而臨床上還有很多與新冠肺炎癥狀類似的病原體感染。因此同時檢測多種病原體并對SARS-CoV-2做出區(qū)分具有重要的臨床意義。

4 多重PCR

多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種可同時檢測多種病原體的核酸檢測技術(shù)。通過在單管中加入多種病原體的特異性引物和熒光探針，多重PCR即可對體系中存在的多種病原體基因組片段同時進(jìn)行擴(kuò)增檢測。相比于單靶標(biāo)PCR，多重PCR提高了待測靶標(biāo)的通量，在臨床和科研中發(fā)揮著巨大作用[36-39]。

4.1多重PCR原理熔解曲線法的原理是：在同一個反應(yīng)體系中加入多個靶標(biāo)的引物和相應(yīng)的熒光

探針。如果體系中存在與某條探針互補(bǔ)的靶標(biāo)，則擴(kuò)增后該探針因消耗完畢而不產(chǎn)生熔解曲線。因此通過分析擴(kuò)增后的熔解曲線可以得知原先存在哪些目標(biāo)序列[37]。見圖1。

4.2多重PCR在SARS-CoV-2檢測方面的應(yīng)用新冠肺炎疫情發(fā)生于2019年12月，這個時段也是其他多種呼吸道病毒感染的高發(fā)期，如流感病毒、副流感病毒、腺病毒等，而且新冠肺炎患者的臨床表現(xiàn)與這些呼吸道疾病患者很相似[40]。在這種情況下，臨床上非常需要能夠快速、準(zhǔn)確鑒別多種病原體，并將SARS-CoV-2與其他常見呼吸道病毒區(qū)分開的檢測方法。但傳統(tǒng)的PCR方法一次只能檢測一種病原體，限制了臨床診斷的速度，因此多重PCR近年來一直被用于呼吸道多重病原體聯(lián)合檢測，對感染類疾病監(jiān)控、分流診療有著長遠(yuǎn)的指導(dǎo)意義[41]。目前美國的Luminex公司，法國的BioMérieux，國內(nèi)的捷諾生物、達(dá)安基因等公司已經(jīng)開發(fā)出了基于多重PCR原理的新冠檢測試劑盒。其中捷諾生物、Luminex、BioMérieux最多可同時檢測22種不同的病原體。

5 結(jié) 語

在新冠疫情檢測方法中，基于PCR的熒光定量PCR、數(shù)字PCR、多重PCR等診斷技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，適用于不同的條件。實時熒光定量PCR發(fā)展最為成熟，在臨床檢測中最為常用。在醫(yī)院、第三方檢測機(jī)構(gòu)等有生物安全防護(hù)條件的場所，熒光定量PCR是SARS-CoV-2檢測的“主力軍”；但其檢測效率受假陰性制約，檢出率只有30%～50%。數(shù)字PCR可定量檢測病毒拷貝數(shù)，且靈敏度高于熒光定量PCR，對于康復(fù)期患者低病毒載量的上呼吸道樣本，數(shù)字PCR仍可檢出SARS-CoV-2；但其檢測成本高，操作復(fù)雜，難以普及。多重PCR可實現(xiàn)多重病原體聯(lián)檢，對感染類疾病監(jiān)控、分流診療有著長遠(yuǎn)的指導(dǎo)意義，但對儀器的要求較高，在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)難以推廣。POCT檢測速度快，操作簡便，可以在家中、車站等無生物安全防護(hù)條件的場所進(jìn)行檢測，但目前上市的POCT檢測儀器數(shù)量有限，且價格昂貴，難以普及。

目前全世界范圍內(nèi)，新冠肺炎疫情仍未消退，其診斷方法仍是當(dāng)下研究的重點(diǎn)，未來我們?nèi)孕枰哽`敏度、高特異性、低成本、易操作、時間短的診斷方法。相信隨著研究的不斷深入，新型診斷技術(shù)會不斷滿足臨床需求，為患者生命健康保駕護(hù)航。