盧志賓,王旭燕,田素景,朱建光,白云冬,高躍
(陸軍第82集團軍醫(yī)院 眼耳鼻喉科,河北 保定 071000)
副鼻竇炎亦稱鼻竇炎,是目前耳鼻咽喉科中常見的一種多發(fā)病,亦是鼻咽癌患者經(jīng)過放療后出現(xiàn)的一種較為常見的并發(fā)癥[1-3]。副鼻竇炎是由多種因素共同作用引起的疾病,其中細菌感染是公認(rèn)的一項重要病因[4-6],主要有革蘭陰性菌和陽性菌的混合共存[7-9]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性菌的細胞壁成分,是導(dǎo)致發(fā)病的關(guān)鍵因子。LPS可與跨膜受體toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)結(jié)合,進而將外源信號傳至細胞內(nèi)。LPS在免疫系統(tǒng)中具有雙重的影響,一方面LPS能促進機體整體或局部的免疫系統(tǒng)抵制細菌感染;而當(dāng)感染嚴(yán)重時,大量的LPS與機體單核巨噬細胞作用,產(chǎn)生大量炎癥因子致使炎癥反應(yīng)失控,出現(xiàn)感染性休克或器官衰竭的現(xiàn)象[9]。槲皮素是黃酮類化合物中較為典型的一種,具有顯著的抗氧化性強的特點,屬于分布范圍最廣、也是人類飲食中含量最多的一種生物類黃酮[10]。槲皮素具有抗菌消炎、抗腫瘤、保肝護肝等功效,具有較強的針對革蘭陰性菌的抗菌效果,可用于預(yù)防各種細菌性感染類的疾病[11-12]。為了探究鼻竇炎的治療方法,本研究通過研究槲皮素對LPS誘導(dǎo)的小鼠副鼻竇炎的影響,進而探究槲皮素改善小鼠副鼻竇炎的作用機制。
1.1.1實驗動物 選取30只清潔級昆明小鼠,雄性,體質(zhì)量(20±2)g,無鼻腔或上呼吸道疾病,購自復(fù)旦大學(xué)動物實驗室。
1.1.2試劑和儀器 氯胺酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字S20060104),LPS(湖南一格制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字S43020003),槲皮素(中國藥品生物制品檢定所,批號100081-200406)。超凈臺(BIOBASE博科超凈臺),4%多聚甲醛(上海碧云天公司),HE染色法試劑盒(上海碧云天公司),光鏡顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng),德國Leica公司)。大鼠抗小鼠高爾基體蛋白GM130單克隆抗體(美國Sigma公司),大鼠抗小鼠高爾基體蛋白GOLPH3單克隆抗體(美國Sigma公司),大鼠抗小鼠半胱氨酸蛋白酶單克隆抗體(美國Sigma公司)。組織蛋白裂解液(上海碧云天公司),BCA法試劑盒(上海碧云天公司),雙向電泳2-DE系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司),PVDF膜(美國Sigma公司),腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(上海碧云天公司)及白介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(上海碧云天公司)。
1.2.1實驗分組與建模 將45只小鼠隨機均分為正常組、模型組和治療組,模型組和治療組小鼠構(gòu)建副鼻竇炎模型,通過肌肉注射150 mg/kg的氯胺酮使其麻醉,使用1 mL注射器吸取1 mg/L的LPS 0.1 mL,通過鼻腔滴入法將LPS滴入小鼠鼻腔內(nèi);對照組滴生理鹽水。造模后治療組每天通過灌胃法給予100 mg/kg的槲皮素,對照組和模型組給予生理鹽水。
1.2.2鼻竇黏膜組織的病理學(xué)檢測 造模兩周后,斷頭處死法處死小鼠,取出小鼠鼻黏膜組織,置于4%多聚甲醛中固定,鼻竇黏膜進行HE切片制作。光鏡下觀察實驗小鼠的鼻黏膜改變,進行鼻黏膜組織病理評分評分標(biāo)準(zhǔn):A黏膜上皮(0~3分)、B增生(0~3分)、C腺體增生(0~3分)、D炎性浸潤(0~3分)、E 變性壞死(0~3分)、F 淋巴樣組織增生、鼻黏膜組織病理指數(shù)=B+3(A+D)+C+E+F,評分越高、病理改變越重。
1.2.3免疫印跡(Western blot)法檢測高爾基體蛋白GM130、高爾基體蛋白GOLPH3和半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,Caspase3)表達 小鼠鼻竇黏膜組織研磨成粉末狀后,加組織蛋白裂解液處理30min,獲取組織蛋白,BCA法檢測蛋白含量;電泳、轉(zhuǎn)膜,大鼠抗小鼠高爾基體蛋白GM130單克隆抗體、大鼠抗小鼠高爾基體蛋白GOLPH3單克隆抗體、大鼠抗小鼠半胱氨酸蛋白酶單克隆抗體孵育,漂洗和顯影,測定高爾基體蛋白GM130、GOLPH3和Caspase3表達。
1.2.4酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測TNF-α和IL-6含量 小鼠鼻黏膜組織,研磨成粉末狀后,按照TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒說明書測定TNF-α和IL-6含量。
實驗各組小鼠在造模前均可正常飲食、飲水、活動自如,精神狀態(tài)良好,毛發(fā)光澤、無掉毛或脫毛、無鼻涕、無噴嚏等癥狀。造模后,正常組小鼠一般情況與造模前相似;模型組小鼠出現(xiàn)流涕、撓鼻、打噴嚏等現(xiàn)象,1周后達到高峰;治療組造模后出現(xiàn)撓鼻、流涕的現(xiàn)象,但抓鼻、撓鼻和流涕的現(xiàn)象較模型組少。
正常組小鼠的鼻腔和鼻竇黏膜組織的結(jié)構(gòu)規(guī)則,無明顯的炎癥細胞浸潤,僅含有少量杯狀細胞;而模型組和治療組小鼠鼻竇黏膜下層有纖維組織增生、漿細胞浸潤、上皮細胞脫落、壞死,上皮細胞分布不均等現(xiàn)象;且模型組較治療組的現(xiàn)象更嚴(yán)重(圖1)。
注:A為鼻竇黏膜組織,B為鼻腔黏膜組織。
與正常組比較,模型組小鼠鼻竇黏膜的病理指數(shù)評分升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,治療組小鼠鼻竇黏膜的病理指數(shù)評分降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
表1 各組小鼠鼻竇黏膜病理指數(shù)評分
與正常組比較,模型組小鼠鼻黏膜組織中GOLPH3和Caspase3表達增加,GM130蛋白表達減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,治療組GOLPH3和Caspase3表達減少,GM130表達增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2和表2。
圖2 各組小鼠高爾基體蛋白GM130、GOLPH3和Caspase3的表達
表2 各組小鼠鼻竇黏膜高爾基體蛋白GM130、GOLPH3和Caspase3的表達
與正常組比較,治療組小鼠鼻竇黏膜組織內(nèi)炎性因子TNF-α和IL-6含量相對升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,治療組小鼠鼻竇黏膜組織內(nèi)炎性因子TNF-α和IL-6含量相對減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。
表3 槲皮素對鼻竇炎小鼠鼻竇黏膜TNF-α和IL-6含量的影響
鼻竇炎是宿主和其周圍環(huán)境因素等相互作用的結(jié)果,每年因鼻竇炎治療的費用接近60億美元,給患者的家庭也帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[13]。隨著鼻內(nèi)鏡外科技術(shù)的不斷發(fā)展,鼻竇炎治療困境得到了一定緩解作用,但仍存在術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn),采用LPS誘導(dǎo)形成的副鼻竇炎小鼠模型經(jīng)過槲皮素治療后,其病理形態(tài)學(xué)較模型組較為接近正常健康小鼠,病理指數(shù)評分較低,且小鼠的鼻黏膜內(nèi)高爾基蛋白GOLPH3和Caspase3表達減少,而GM130蛋白表達增加,同時炎癥因子TNF-α和IL-6含量減少。高爾基體屬于一個動態(tài)結(jié)構(gòu),可不斷的與其他細胞器進行脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的交流[14]。GOLPH3屬于高爾基體來源的一種應(yīng)激相關(guān)蛋白,主要位于高爾基體的外膜處,該蛋白的表達水平和機體細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平之間存在著正相關(guān)[15]。該基因是對于高爾基體的結(jié)構(gòu)及其順行轉(zhuǎn)運等方面存在著重要影響。GM130屬于高爾基體中一種順式基質(zhì)蛋白,可用于維持帶狀形態(tài)特征結(jié)構(gòu)。當(dāng)GM130磷酸化后便與P115結(jié)合能力降低,是造成高爾基復(fù)合物裂解的主要原因之一。在對糖尿病性心肌病的研究中發(fā)現(xiàn),外源性精胺能夠通過降低GM130表達,增加caspase 3和GOLPH 3表達,用于抑制高爾基體應(yīng)激,達到減輕高糖誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷的效果。因此,GOLPH3和GM130是高爾基應(yīng)激反應(yīng)中重要的參與者[16]。
上呼吸道炎癥性疾病的發(fā)病因素較為復(fù)雜,其發(fā)病過程中具有多種炎性細胞、免疫細胞和細胞因子的參與[17]。Dellacono等[18]研究發(fā)現(xiàn),在慢性炎癥鼻黏膜組織中具有白介素-4(interleukin-4,IL-4)和干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)的表達,且該兩種因子比例和患者鼻黏膜內(nèi)Th2/Th1炎癥反應(yīng)類型存在相關(guān)性。在用LPS刺激細胞6 h后發(fā)現(xiàn),0~100 mg/L的LPS可刺激IFN-γ分泌增加,當(dāng)其在0~20 mg/L時,可刺激IL-4分泌增加[19]。因此認(rèn)為高濃度的LPS刺激可導(dǎo)致毒性損傷增強。在對慢性鼻竇炎患者的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)長期給予患者低劑量的大環(huán)內(nèi)酯類藥物進行治療時,其治療效果良好,可有效降低機體內(nèi)炎癥因子水平[20]。在早期的鼻竇炎發(fā)病因素的研究中,臨床上大部分主張用抗生素作為治療鼻竇炎的主要藥物,證實炎性反應(yīng)和鼻竇炎之間具有相關(guān)性。
槲皮素被認(rèn)為是一種常見的黃酮醇類物質(zhì),當(dāng)其被人體消化吸收后,形成結(jié)合型物質(zhì),主要以硫酸化、甲基化和葡萄糖磷酸化的形式存在[21]。在對槲皮素和其代謝物的研究中發(fā)現(xiàn),生理濃度為2 μmol/L和10 μmol/L的槲皮素可有效抑制機體內(nèi)細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)及單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)趨化因子的表達,其中槲皮素的主代謝物對這些炎癥因子的抑制作用低于槲皮素[22]。有研究認(rèn)為,槲皮素對人中性粒細胞無明顯的保護作用。但在LPS誘導(dǎo)小鼠PAW264.7巨噬細胞的研究中發(fā)現(xiàn),槲皮素可有效抑制由LPS刺激引起的IL-1、TNF-α和IL-6等因子的轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成[23]。槲皮素代謝物對于內(nèi)皮細胞具有有效的保護作用。槲皮素作為一種抗菌因子可有效降低機體內(nèi)的炎癥反應(yīng),減少炎性因子的分泌[24]。中藥中所含的槲皮素對革蘭陰性菌的抑菌功效比革蘭陽性菌強,其中表現(xiàn)在對3種真菌的強抑制性。因此,槲皮素作為廣譜類的抗菌物質(zhì),可用于治療細菌感染性疾病。槲皮素對于LPS引發(fā)的機體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答具有顯著抑制作用。槲皮素的作用機制可能通過核因子KB(nuclear factor-kB,NF-kB)活化后,抑制細胞內(nèi)ICAM-1因子的表達達到治療作用。LPS刺激后,經(jīng)槲皮素治療可有效抑制其黏附分子CD11b/CD18和CD62L的表達,降低LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的活化效應(yīng),從而減少炎癥細胞浸潤。
綜上所述,槲皮素可通過調(diào)節(jié)高爾基應(yīng)激抑制由LPS誘導(dǎo)的小鼠鼻竇炎的炎癥反應(yīng),達到改善小鼠鼻竇炎癥狀的作用。