UHPLC法同時測定鐵莧菜中4種成分含量

馬琦峰，劉威，夏林波，鄧仕任

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

鐵莧菜(AcalyphaaustralisL.)為大載科鐵莧菜屬一年生草本，又稱海蚌含珠，我國大部分省區(qū)均有分布，有止瀉、止血、除濕、解毒之功效，是止瀉藥莧菜黃連素膠囊的主要成分[1]?，F(xiàn)代研究表明，鐵莧菜中主要含有有機酸、黃酮、萜類、生物堿等多種成分，而原兒茶酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯等有機酸類和蘆丁等黃酮類物質(zhì)是其發(fā)揮抗菌、抗炎、止血等藥理作用活性成分。目前對于鐵莧菜的研究及含量測定的報道并不多見[2-4]，這對鐵莧菜的質(zhì)量控制是不利的。本論文收集了10批次遼寧地區(qū)野生鐵莧菜藥材，并構(gòu)建了一種基于超高效液相色譜(UHPLC)法的鐵莧菜中4種活性成分的含量測定方法，該方法的建立將有助于鐵莧菜的全面質(zhì)量控制[5-10]。

1 試驗材料

1.1 試驗藥品 沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、蘆丁等4種標準品，均購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均大于98%。乙腈為色譜純(Tedia，美國)；水為超純水，其余試劑均為分析純。10批次鐵莧菜藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張建奎副教授鑒定，均為大戟科植物鐵莧菜(AcalyphaaustralisL.)的干燥全草，具體信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 試驗儀器 Agilent 1290 Infinity液相色譜系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司)；Poroshell 120 SB-C18(3.0 mm×150 mm，2.7 μm，安捷倫科技有限公司)；AL204型電子天平(梅特勒托利多公司)；KQ2200型超聲清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；Milli-Q Academic超純水儀(密理博公司)。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 A相為0.1%甲酸-水，B相為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫條件為0～3 min，B:5%→10%；3～5 min，B:10%→25%；5～10 min，B:25%→30%。柱溫：40 ℃，流速：0.6 mL·min-1，檢測波長為265 nm。

2.2 供試品溶液制備 取1號鐵莧菜藥材，粉碎后過三號篩，精密稱定約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，冷浸1 h后，超聲提取(功率80 W，頻率40 kHz)50 min，放冷，甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、蘆丁等4種標準品適量，甲醇溶解制成每1 mL分別含沒食子酸0.040 mg、原兒茶酸0.10 mg、沒食子酸甲酯0.32 mg和蘆丁0.09 mg的混合對照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液0.5、1、1.5、2、3、4、5 μL，分別注入液相色譜儀，在“2.1”項下色譜條件進行分析。以峰面積Y對絕進樣量X(μg)繪制標準曲線，回歸方程見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗 取1號鐵莧菜藥材共6份，分別制成6份樣品溶液。將各樣品溶液依次檢測，記錄各次峰面積并計算藥材中沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、蘆丁等4種成分的含量分別為0.37、1.01、3.25、0.86 mg·g-1，RSD分別為0.90%、2.20%、1.53%、1.48%，結(jié)果顯示重復(fù)性符合含測要求。

2.6 精密度試驗 取“2.3”項下混合對照品3 μL，重復(fù)進樣6次，沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、蘆丁等4種成分的峰積分面積平均值分別為228.7、556.6、1 512.9、659.4，RSD分別為0.43%、1.21%、2.68%、2.02%，表明儀器具有良好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(1號樣品)，室溫條件下密封放置0、4、16、24、32、36 h后，分別進行含量測定，計算各次樣品中沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、蘆丁等4種成分的峰面積RSD分別為1.36%、1.10%、0.88%、1.74%，表明樣品溶液能穩(wěn)定36 h。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的鐵莧菜(1號樣品)6份，每份約1 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，每組精密加入適量混合對照品溶液，再按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(n=6)

2.9 實際樣品測定 分別稱取10個批次的鐵莧菜藥材粉末各約1 g，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣量3 μL進行色譜分析，采用外標法以峰面積計算每個樣品中4種成分的含量，結(jié)果見圖1、表4所示。

A.鐵莧菜供試品；B.混合對照品 1.沒食子酸；2.原兒茶酸；3.沒食子酸甲酯；4.蘆丁圖1 UHPLC色譜圖

表4 含量測定結(jié)果(mg·g-1 ,n=3)

3 討論

3.1 鐵莧菜中化學(xué)成分含量測定的討論 鐵莧菜中化學(xué)成分含量測定報道較少，多以沒食子酸含量為檢測標準，且分析時間一般較長，不利于多成分的快速分析。本文建立了基于UHPLC法的鐵莧菜多成分快速分析方法，可在10 min內(nèi)測定4種酚酸和黃酮類成分的含量，可為鐵莧菜藥材的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

3.2 供試品制備方法的討論 根據(jù)鐵莧菜中酚酸和黃酮類化合物的相關(guān)性質(zhì)，考察了回流提取法和超聲提取法這兩種提取方法，結(jié)果顯示了這兩種提取方法無顯著性差異，因此選擇操作更加簡便的超聲提取法。起初以乙醇作為提取溶劑，結(jié)果顯示用該提取液峰較少，峰形較差。之后用甲醇作為提取溶劑，得到的色譜峰較多，能匹配出本試驗所測的4種成分，且峰形較好，因此選擇甲醇作為提取溶劑，且甲醇濃度越大，提取效率越高。

3.3 色譜條件的優(yōu)化討論 通過檢測器全波長掃描，在波長265 nm處4個成分呈現(xiàn)較好的吸收峰。分別考察了甲醇-水、甲酸-水、乙腈-水、甲酸-乙腈等流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示以甲酸-水和甲酸-乙腈所配成的混合流動相系統(tǒng)，得到的峰形較對稱，采用等度洗脫，無法得到較好的分離度，因此采用梯度洗脫，經(jīng)過多次試驗，決定隨著時間的延長來按一定程序增大甲酸-乙腈在混合流動相系統(tǒng)中的比例，使流動相的極性梯度下降，從而使被分離的物質(zhì)按順序流出，且在較短的時間內(nèi)呈現(xiàn)出較好的分離度，從而達到含量測定的要求。

3.4 采收地點對本品含量的影響 由含量測定結(jié)果可知，3個采集地的野生鐵莧菜藥材有明顯的相似性，均以沒食子酸甲酯的含量為最高，而沒食子酸含量最低。但同時，不同產(chǎn)地的藥材也體現(xiàn)出了明顯的差異性。本溪產(chǎn)樣品中，沒食子酸和沒食子酸甲酯的含量較其他產(chǎn)地高，但蘆丁含量偏低；丹東產(chǎn)樣品，則是蘆丁含量較高，而原兒茶酸含量偏低；鞍山產(chǎn)樣品，各成分含量比較平均。上述差異也可為鐵莧菜藥材的產(chǎn)地區(qū)分提供借鑒的思路。