六君子湯相態(tài)拆分及表征研究

尚爾雨，馬曉乾，于新，孫爽 *，申國濤*

(1.黑龍江省森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040；2；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

湯劑是中藥中最為悠久的劑型之一，可以適應(yīng)中醫(yī)辨證論治的原則，且具備易吸收、療效快、作用強(qiáng)等特點，在中醫(yī)的臨床應(yīng)用中也最為普遍[1-3]。中藥湯劑是一個復(fù)雜的分散體系，其有效成分以溶質(zhì)或分散相在分散介質(zhì)中形成真溶液、膠體、混懸液和乳濁液等不同分散相態(tài)[4-6]。在多種復(fù)方中藥湯劑中均觀察到直徑在幾十到幾百納米不等的納米粒子，藥液中的納米粒子可通過氫鍵等方式結(jié)合難溶性有效成分來增強(qiáng)其難溶性成分的溶解度，從而增強(qiáng)藥液的療效。對于中藥復(fù)方中納米相態(tài)等分散體系的研究開展于1970年，一方面是由于當(dāng)時還沒普及掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、馬爾文納米粒徑儀等表征技術(shù)，一方面鑒于當(dāng)時中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究還不夠深入，導(dǎo)致不能精準(zhǔn)獲取膠體粒子的形態(tài)和溶解參數(shù)[7]。例如板藍(lán)根湯劑經(jīng)過離心除雜后發(fā)現(xiàn)其具有明顯的丁達(dá)爾現(xiàn)象，通過相差顯微鏡、透射電子顯微鏡(TEM)等手段觀察板藍(lán)根湯劑膠體顆粒的形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根湯劑膠體中存在粒徑為60～180 nm大小不等的球形和橢球形的納米顆粒組分，并且顆粒不穩(wěn)定會相互聚集成小丘狀或粘連成串[8]；通過對當(dāng)歸補(bǔ)血湯主要成分進(jìn)行分離與表征，在提取液中觀察到明顯的丁達(dá)爾現(xiàn)象，還有粒徑在50～100 nm和1 000 nm以上的質(zhì)點[9-10]。然而，有效成分，尤其是難溶性成分是如何分散到人體中并被人體吸收的，這些都值得我們?nèi)ド钊胙芯刻接憽?/p>

六君子湯出自《醫(yī)學(xué)正傳》，為四君子湯加陳皮、半夏而成。作為基礎(chǔ)方加味治療脾胃病證，應(yīng)用非常廣泛，如脾胃氣虛兼痰濕證、食少便溏、胸脘痞悶、嘔逆等?，F(xiàn)代臨床常用于慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍等屬脾胃氣虛者。試驗研究表明六君子湯藥理作用廣泛，可通過調(diào)整細(xì)胞因子間的網(wǎng)絡(luò)平衡，改善胃腸道的內(nèi)分泌功能，減輕胃黏膜的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對胃黏膜的保護(hù)作用。但由于受條件限制，迄今為止，對六君子湯進(jìn)行深入的分析和研究很少，其研究仍局限于湯劑藥理作用。因此本研究以六君子湯作為研究對象，通過對六君子湯分散體系進(jìn)行各相態(tài)拆分，并對六君子湯中納米相態(tài)進(jìn)行觀察研究，探討納米相態(tài)與六君子湯補(bǔ)氣理氣的功效之間的關(guān)系。通過研究六君子湯中分散體系的組成，采用透析與超速離心相結(jié)合的方法，對六君子湯進(jìn)行了真溶液相態(tài)、納米相態(tài)和沉淀相態(tài)拆分，并采用TEM、粒徑分析等方法，對其中納米相態(tài)進(jìn)行了表征，以期為后期研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AB265-S分析天平(瑞士Mettler公司)； H-2050R超速低溫離心(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；HZS-HA水浴恒溫振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；JEM-2010HR透射電鏡(日本電子株式會社)；Zetasizer Nano-ZS90馬爾文粒徑儀(英國馬爾文儀器有限公司)；I1033透析袋(Biosharp生物科技有限公司)；BJH-W300K電陶瓷鍋(廣東天際電器股份有限公司)。

1.2 藥物與試劑 陳皮、人參、半夏、茯苓、白術(shù)、炙甘草，均購于哈爾濱市同仁堂大藥房，以上藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實訓(xùn)教研室呂邵娃教授鑒定為正品，標(biāo)本存放于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實驗室。EDTA (廣州市化工試劑有限公司，分析純)；NaHCO3(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，分析純)；試驗用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 透析袋的預(yù)處理 用剪刀將透析袋剪成恰當(dāng)長度約 20 cm。稱取0.15 g EDTA在超聲作用下溶解于500 mL蒸餾水中，得到1 mmol·L-1EDTA溶液。在超聲的作用下，用NaHCO3調(diào)節(jié)上述溶液到pH=8。將所得溶液液體分為兩份各250 mL，用于煮透析袋。將透析袋放置于1 mmol·L-1EDTA-2Na(pH=8)溶液中煮沸 10 min。從 EDTA-2Na 液體中取出透析袋，用蒸餾水洗滌干凈。將透析袋再放置于1 mmol·L-1EDTA-2Na(pH=8)溶液中煮沸 10 min。取出，用蒸餾水清洗數(shù)次，再將冷卻后的透析袋浸沒于75%乙醇溶液中，存放于4 ℃冰箱冷藏備用。用前，用蒸餾水充分清洗。

2.1.1 六君子湯的煎煮及預(yù)處理 六君子湯(Ⅰ)的煎煮工藝為藥材浸泡1.5 h，煎煮2次，每次加10倍量水，每次煎煮60 min，將藥液濃縮至生藥量為0.55 g·mL-1。將六君子湯經(jīng) 6 000 r·min-1離心 30 min，得沉淀相態(tài)(Ⅱ)，所得樣品進(jìn)行透析-離心處理。

2.1.2 樣品透析-超速離心處理 將六君子湯加至透析袋二分之一處，隨即將透析袋裝入加有200 mL蒸餾水的燒杯中，于水浴恒溫振蕩器 120 r·min-1震蕩30 min，取出透析袋中六君子湯樣品；于 10 000 r·min-1離心30 min，取上清液，上述透析-超速離心操作記為1 次，以此重復(fù)5次，取上清液樣品。燒杯中的液體為真溶液相態(tài)(Ⅲ)，透析袋中的液體為納米相態(tài)(Ⅳ)。

2.1.3 樣品丁達(dá)爾現(xiàn)象觀察 將每次透析-離心后的六君子湯樣品分別制成原液、5倍稀釋液、10倍稀釋液3種樣品并進(jìn)行丁達(dá)爾現(xiàn)象觀察，結(jié)果見表1、圖1。

表1 透析離心后樣品丁達(dá)爾現(xiàn)象

圖1 透析-離心后樣品丁達(dá)爾現(xiàn)象

根據(jù)以上試驗結(jié)果看出六君子湯樣品稀釋10倍丁達(dá)爾現(xiàn)象都較為模糊，因此不適合進(jìn)行下一步試驗。而透析-離心1次的5倍稀釋液，透析-離心2次的5倍稀釋液，透析-離心3次的5倍稀釋液，透析-離心4次的原液及5倍稀釋液、透析-離心5次的原液這些樣品的丁達(dá)爾現(xiàn)象較為清晰，可以選取進(jìn)行TEM觀察。

2.1.4 六君子湯納米相態(tài)TEM觀察 用滴管吸取少許制備的六君子湯納米相態(tài)滴于支持網(wǎng)(超薄碳膜)上，待干燥后，再滴一次；觀察支持網(wǎng)(超薄碳膜)，若無明顯物體，再滴一滴樣品；TEM 下觀察并拍照。

2.2 試驗結(jié)果

2.2.1 透析-超速離心次數(shù)與稀釋倍數(shù)考察 不同透析-超速離心次數(shù)與稀釋倍數(shù)所得TEM結(jié)果見表2、圖2。

圖2 六君子湯納米相態(tài)不同透析-離心次數(shù)與稀釋倍數(shù)的TEM圖

表2 六君子湯樣品TEM觀察效果

試驗結(jié)果表明：由于樣品中淀粉粒較多，因此影響圖像的清晰度，導(dǎo)致圖A、B粒子邊緣不清晰，僅能觀察到模糊的球狀物質(zhì)；圖C團(tuán)聚物邊緣不清晰，但是可見明顯的球狀粒子；圖D團(tuán)狀物聚集，粒子清晰可見；圖E可以看到團(tuán)狀物聚集，粒子清晰可見；圖F只能看到團(tuán)狀物，而且邊緣不清晰。由此可知，隨著透析-離心次數(shù)的增加與樣品稀釋倍數(shù)的增加，樣品里的納米粒更加清晰可見，其中透析-離心4次稀釋5倍的樣品圖像最為清晰，因此選用作為下一步試驗。

2.2.2 室溫放置時間考察 將于室溫放置 0、8、24 h 后的透析-離心4次稀釋5倍的六君子湯納米相態(tài)樣品，按照上述制片步驟進(jìn)行制片，進(jìn)行TEM觀察并拍照，結(jié)果見表3、圖3。

表3 樣品放置時間與TEM觀察效果

圖3 六君子湯納米相態(tài)放置不同時間的TEM圖

試驗結(jié)果表明：圖A圓球狀粒子清晰，可見粒子外面包裹的保護(hù)層，粒子內(nèi)的物質(zhì)可清晰看清，圖像效果好；圖B可見連續(xù)的葡萄狀粒子，粒子外面包裹的保護(hù)層與粒子內(nèi)的物質(zhì)雖然能看清，但較圖A模糊；圖C可見團(tuán)狀物，團(tuán)狀物內(nèi)可見粒子，但是粒子較為模糊，粒子聚集。因此表明樣品室溫下放置0 h，TEM圖像最為清晰。

2.2.3 最優(yōu)方案的六君子湯納米相態(tài)TEM觀察 TEM下觀察結(jié)果表明，六君子湯樣品中存在納米顆粒，結(jié)果見圖4。

圖4 六君子湯納米相態(tài)TEM圖

2.2.4 六君子湯納米相態(tài)的粒徑分布及其電位大小 利用馬爾文粒徑儀對六君子湯納米相態(tài)的粒徑大小及其分布進(jìn)行測定。在室溫條件下，取適量的六君子湯納米相態(tài)溶液，加入粒徑儀的樣品管中進(jìn)行分析。試驗結(jié)果表明，粒徑主要集中在100 nm，此外，還存在少量粒徑大于100 nm的粒子。上述結(jié)果與TEM結(jié)果相互吻合，結(jié)果見圖5A。

利用馬爾文粒徑儀對六君子湯納米體系進(jìn)行電位測定。在室溫條件下，取適量的六君子湯納米相態(tài)溶液，置于粒徑儀的微電泳池中進(jìn)行分析，并記錄數(shù)據(jù)。試驗結(jié)果表明，六君子湯納米相態(tài)的電位為-2.22～-1.97 mV，說明體系不穩(wěn)定，這可能是由于體系中出現(xiàn)不同程度的團(tuán)聚造成的，結(jié)果見圖5B。

A.粒徑強(qiáng)度分布圖；B.Zeta電位分布圖圖5 六君子湯納米相態(tài)的表征

3 討論

前期文獻(xiàn)研究表明，使用超薄碳膜作為支持網(wǎng)、透析袋作為拆分介質(zhì)，有利于中藥湯劑中納米相態(tài)的拆分。因此，本試驗在以上兩個方法的基礎(chǔ)上，利用丁達(dá)爾現(xiàn)象初步判斷六君子湯中是否存在納米相態(tài)，并對樣品透析-離心次數(shù)、稀釋倍數(shù)以及樣品放置時間進(jìn)行了考察。本試驗通過對六君子湯中的相態(tài)拆分進(jìn)行分離與表征，從六君子湯中發(fā)現(xiàn)了納米粒，并以分離的納米粒子的形態(tài)為評價指標(biāo)，對透析-超速離心次數(shù)(1 次、2 次、3 次、4 次及 5 次)，樣品稀釋倍數(shù)(0倍、5倍、10倍)，樣品溶液室溫放置時間 (0、8、24 h)等方面進(jìn)行考察，優(yōu)化了拆分工藝，最終確定透析與超速離心4次，樣品稀釋5倍，室溫放置0 h的拆分工藝。按照最佳拆分工藝制備六君子湯納米相態(tài)3批，考察各批次六君子湯納米相態(tài)及TEM形態(tài)。結(jié)果表明，納米相態(tài)中存在納米顆粒，TEM圖像清晰可見球狀團(tuán)聚物，圖像良好，說明該拆分工藝的重現(xiàn)性良好，工藝可行。

有研究報道，中草藥水煎液中存在納米聚集體，盡管它們的藥理學(xué)性質(zhì)和生成機(jī)理仍然是未知的，但是納米聚集體的存在提示我們中藥湯劑可能是通過納米相態(tài)來實現(xiàn)增溶。從六君子湯配伍增效角度來看，難溶性成分(人參中的人參皂苷、茯苓中的茯苓酸、陳皮中的黃酮)的溶出度增大，推測白術(shù)和甘草中的植物性多糖、根莖成分中所含的無機(jī)物質(zhì)、甘草中的甘草酸(表面活性物質(zhì))在整個湯劑的形成過程中，應(yīng)該各自扮演著不同的角色，從而形成了一種天然的納米相態(tài)。但是該體系的存在及機(jī)制尚不明確，推測六君子湯中納米相態(tài)的大分子物質(zhì)形成核-殼結(jié)構(gòu)，于TEM圖中觀察到類似結(jié)構(gòu)，有待于今后科研工作的進(jìn)一步證實。