基于網絡藥理學探究百合抗抑郁的作用機制

邱奕平，沈其霖

(成都中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，四川 成都 610075)

抑郁癥又稱為抑郁障礙，是一類以情緒低落為臨床主要特征的心境障礙疾病.抑郁癥屬于西醫(yī)中的病名，但是在我國古代對于該病的論述也比較多，在古代文獻中“郁癥”一詞語首先出現在明代虞摶的《醫(yī)學正傳》中，根據抑郁診斷標準(ICD-10)中規(guī)定的癥狀，發(fā)現其對應中醫(yī)范疇中的虛證，主要以心、脾、腎虧虛為主，如缺乏興趣、沒有愉快感(心神失養(yǎng))、疲勞無力(脾虛或腎虛)等.根據病因病機，應益腎補虛、調氣安神為主，據此臨床上也取得了較好的療效.

百合為百合科植物卷丹

Lilium

lancifolium

Thunb.、百合

Lilium

brownii

F.E.

Brown

var

.

viridulum

Baker.或細葉百合

Lilium

pumilum

DC.的干燥肉質鱗葉.其性甘、寒，歸心肺經，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的作用；用于失眠多夢，陰虛燥咳等癥.百合中含有豐富的甾體皂苷、甾醇、酚酸甘油酯、黃酮、苯丙素類以及多糖等化學成分，現代藥理研究表明百合具有止咳祛痰、鎮(zhèn)靜催眠、提高免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物功能.近年來研究發(fā)現百合對抑郁癥也具有較好的治療效果.郭秋平等發(fā)現百合皂苷能夠改善抑郁模型大鼠快感缺失以及行為遲緩等癥狀.王瑛等發(fā)現百合總皂苷能明顯縮短小鼠懸尾的不動時間以及游泳不動時間.因此，在中醫(yī)臨床治療抑郁癥中也常配伍使用百合.

雖然百合中的某些化學成分具有一定抗抑郁效果，但是其作用機制尚未完全闡明.筆者從中醫(yī)整體觀念的思路出發(fā)，利用現代藥理學的研究方法，對百合潛在的作用靶點和抑郁相關的靶點進行篩選分析，結合通路闡述百合抗抑郁的作用機制，以期為抗抑郁藥物的使用提供新的研究思路.

1 材料與方法

1.1 百合有效成分及靶點篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)獲得百合有效成分.隨后以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為條件篩選百合有效活性成分及相關靶點.

1.2 抑郁相關靶點的篩選

通過GeneCard (https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)等數據庫以“depression”為關鍵詞，檢索與抑郁癥相關的靶基因，得到疾病相關的靶點，隨后通過Python對藥物靶點和疾病相關靶點進行交集，得到關鍵靶點，并在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)中找到與關鍵靶點相匹配的基因.

1.3 藥物成分-靶點網絡圖構建

通過Cytoscape3.6.1軟件繪制并構建“藥物成分-疾病關鍵靶點”的關系網絡圖.

1.4 蛋白互作圖(PPI)構建與分析

將篩選出的關鍵靶點列出，導入String數據庫(https://string-db.org/)，并限定物種為人，其他參數保持默認設置，通過Multipe protein工具，構建蛋白互作的網絡模型，最終獲得關鍵靶點之間相互作用網絡.

1.5 關鍵靶點功能富集分析

通過David數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)和R語言對獲得的基因進行GO(gene ontology)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，并以

p

<0.05作為篩選條件，分別繪制出柱狀圖和氣泡圖.

2 結果與分析

2.1 百合活性成分的篩選

通過TSCMP數據庫總共檢索到百合的化學成分84個，以OB≥30%和DL≥0.18，篩選出符合具有良好口服生物利用度和類藥性的有效成分7個，見表1所列.

表1 百合潛在活性成分

2.2 百合抗抑郁的潛在作用靶點預測

通過TCMSP數據庫的檢索，得到與百合成分相關的靶點464個，在OB≥30%和DL≥0.18的基礎上篩選出具有良好口服生物利用度和類藥性的有效成分靶點85個.通過Python對藥物作用靶點和疾病相關靶點進行交集，共獲得關鍵靶點18個，分別是：PGR，NCOA1，NOCA2，KCNH2，CHRM3，CASP3，CASP8，CASP9，PON1，NR3C2，CHRM1，ADRA1A，GABRA1，CHRNA2，CHRM2，PTGS1，CHRM4，AR.

2.3 藥物成分-關鍵靶點網絡的構建與分析

將百合的有效成分、篩選出的關鍵靶點導入Cytoscape3.6.1軟件，構建藥物成分-關鍵靶點網絡圖(圖1)，其中紅色代表百合的有效化學成分，綠色代表百合-抑郁癥的共同靶基因，百合主要通過7種有效成分作用于15個靶標，每個化合物連接了不同的作用靶點，且每個靶點之間也相互作用，表明百合抗抑郁是多個靶點和多個化學成分共同作用的結果.

圖1 百合抗抑郁的“藥物成分-關鍵靶點”調控網絡圖

2.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖(PPI)

將17個靶點導入STRING在線數據庫中，構建蛋白互作圖(PPI)網絡模型，如圖2所示，共18個節(jié)點，有3個節(jié)點未發(fā)生相互作用，平均節(jié)點度(Degree)為2.78，該值越大則表示該靶點離核心地位越近，如圖2中的雄激素受體 (AR)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、毒蕈堿型膽堿受體M1(CHRM1)，這些關鍵靶點很有可能是百合能夠起到抗抑郁作用的關鍵因素.

圖2 百合抗抑郁靶蛋白PPI網絡圖

2.5 GO富集分析

百合關鍵靶點的GO富集通路分析結果如圖3所示.圖3顯示，18個靶點影響到了16個生物學功能(

p

<0.05)，主要包括突觸傳遞，膽堿能、磷脂酶C激活G蛋白偶聯的乙酰膽堿受體信號通路(GO:0007207)，腺苷酸環(huán)化酶抑制G蛋白偶聯乙酰膽堿受體信號通路(GO:0007197)，凋亡過程(GO:0006915)，調節(jié)血管平滑肌收縮等生物過程(GO:0003056)；G蛋白偶聯乙酰膽堿受體(GO:0016907)、半胱氨酸型內肽酶(GO:0097153)等分子參與的凋亡過程；且這些靶點主要參與細胞連接、突觸或者質膜的組成.

橫坐標對應的是GO號，縱坐標對應的是目標基因的數量.圖3 百合關鍵靶點的GO生物學功能富集

2.6 KEGG富集分析

百合關鍵靶點的KEGG富集通路分析結果如圖4所示.圖4中18個靶點顯著富集到圖中所示的11條信號通路上(

p

<0.05).此結果表明，百合可能通過多條信號通路來發(fā)揮抗抑郁的效果.

橫坐標對應的是富集系數，縱坐標對應的是相關通路.圖4 百合關鍵靶點的KEGG通路富集分析

3 討 論

通過網絡藥理學分析發(fā)現，篩選獲得的可能與抗抑郁相關的化學成分主要有豆甾醇、β-谷固醇、異海藻酸等.其中β-谷固醇是一類對心血管系統具有保護作用的膳食因子，有研究表明，β-谷固醇具有改善小鼠空間學習記憶的能力，對大腦有潛在的積極作用.而豆甾醇亦具有保護神經的作用，Yadav等研究發(fā)現，豆甾醇能夠明顯減少由氯胺酮引起的小鼠的一些精神病癥狀，增加谷胱甘肽、減少多巴胺和丙二醛等物質的產生.

筆者通過構建百合有效成分-關鍵靶點的網絡，發(fā)現百合可能是通過半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)、雄激素受體(AR)以及毒蕈堿型膽堿受體(CHRM1)等核心的靶基因起到治療抑郁癥的作用.Caspase-3在細胞凋亡過程中扮演重要角色，近年來針對該蛋白與抑郁癥之間的關聯，國內外學者做了許多探究.蔡珍珍等發(fā)現柴胡皂苷能夠改善大鼠的抑郁行為，可能是通過抑制海馬區(qū)Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達；傅錦華等通過比較發(fā)現，疏肝解郁膠囊能夠顯著改善大鼠抑郁的癥狀，促進抑郁大鼠CA3區(qū)神經細胞損傷的修復并減少大鼠腦組織Caspase-3蛋白的表達.CHRM1類受體蛋白能夠參與情緒、學習記憶等功能調節(jié).研究發(fā)現CHRM1可能參與到抑郁癥及精神分裂等神經系統相關疾病的治療.而AR可能通過非基因效應改變神經元的興奮性或神經遞質的釋放.研究表明AR能增加單胺氧化酶活性，從而引起心境障礙.

KEGG通路富集的結果提示神經活性配體-受體相互作用、膽堿能突觸和p53等信號通路可能與百合抗抑郁的作用有重要關聯.神經活性配體-受體相互作用信號通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合，參與神經遞質的傳導，在其他抗抑郁的中藥和復方中，該通路均被顯著富集，推測這一通路可能在百合抗抑郁過程中也具有關鍵作用.p53信號通路是一類能夠調節(jié)細胞活動的通路，該通路上的p53基因是神經細胞凋亡過程中的特異性分子，大量研究表明p53基因參與許多神經疾病的發(fā)生，如抑郁癥、神經退行性疾病、癲癇等.而p53在百合抗抑郁調控網絡中的機制還有待于進一步的研究.膽堿能突觸是以乙酰膽堿為傳遞介質的突觸，能夠通過激動受體改變神經元興奮性，影響突觸傳遞.Mineur等發(fā)現阻斷小鼠海馬區(qū)的乙酰膽堿降解能夠誘導小鼠抑郁和焦慮的行為；此外當抑郁癥患者服用了中樞擬膽堿類藥物后，能夠有效減輕并發(fā)型抑郁和雙向抑郁患者的抑郁癥狀.因此百合的抗抑郁作用極有可能是通過對以上信號通路的調節(jié)達到治療的目的.

綜上，通過網絡藥理學的技術，構建百合有效成分-關鍵靶點的復雜網絡，對篩選出的靶點進行GO生物學功能和KEGG富集分析，系統探討了中藥材百合潛在的抗抑郁分子機制，為今后進一步研究和篩選百合抗抑郁藥物提供參考.