響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備驢血紅蛋白源二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽

劉丹 吳曉彤

摘 要：食源性二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）抑制活性肽成為近年來健康產(chǎn)品研究的方向之一。本研究以驢血紅蛋白為原料，采用計算機(jī)模擬蛋白水解方法篩選最佳蛋白酶，研究酶解時間、溫度和加酶量對蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）和酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制率的影響，響應(yīng)面優(yōu)化酶解法制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的工藝條件。結(jié)果表明，最佳蛋白酶為蛋白酶K，驢血紅蛋白源制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳酶解條件為：底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶解時間3.15 h、溫度65 ℃、pH 8、加酶量400 U/g，此條件下2 mg/mL酶解產(chǎn)物對DPP-Ⅳ的抑制率為53.44%。

關(guān)鍵詞：驢血紅蛋白;蛋白酶K;響應(yīng)面分析法;二肽基肽酶Ⅳ抑制活性肽

Optimization of Enzymatic Preparation of Dipeptidyl Peptidase-Ⅳ Inhibitory Peptides from Donkey Hemoglobin

LIU Dan， WU Xiaotong*

（School of Life Sciences， Inner Mongolia University， Hohhot 010000， China）

Abstract： Food-derived dipeptidyl peptidase （DPP） Ⅳ inhibitory peptide has become an important direction of research on dietary supplements in recent years. In this study， donkey hemoglobin was hydrolyzed with proteases to produce DPP-Ⅳ inhibitory peptide. The best protease was selected by computer simulation of protein hydrolysis. The effects of hydrolysis time， temperature and enzyme dosage on the degree of hydrolysis and DPP-Ⅳ inhibitory activity were studied. The process conditions were optimized by response surface methodology. The results showed that protease K was the best enzyme for the production of DPP-Ⅳ inhibitory peptide. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were as follows： substrate concentration 1%， hydrolysis time 3.15 h， temperature 65 ℃， pH 8.00， and enzyme dosage 400 U/g. The inhibition rate of DPP-Ⅳ by 2 mg/mL of the hydrolysate prepared using these conditions was 53.44%.

Keywords： donkey hemoglobin; protease K; response surface analysis; dipeptidyl peptidase Ⅳ inhibitory peptides

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201225-296

中圖分類號：TS251.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）02-0019-06

引文格式：

劉丹， 吳曉彤. 響應(yīng)面法優(yōu)化酶法制備驢血紅蛋白源二肽基肽酶-Ⅳ抑制活性肽[J]. 肉類研究， 2021， 35（2）： 19-24. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201225-296.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LIU Dan， WU Xiaotong. Optimization of enzymatic preparation of dipeptidyl peptidase-Ⅳ inhibitory peptides from donkey hemoglobin[J]. Meat Research， 2021， 35（2）： 19-24. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201225-296.? ? http：//www.rlyj.net.cn

隨著社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人們的生活方式特別是飲食習(xí)慣發(fā)生巨大變化，營養(yǎng)攝入的不均衡導(dǎo)致肥胖和糖尿病等慢性代謝疾病的發(fā)生率逐年上升。糖尿病已逐漸成為世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的社會健康問題，預(yù)計到2040年，將會有6.42億成年人患糖尿病[1]。

二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）抑制劑是新型糖尿病治療藥物[2]。然而，長期服用合成的DPP-Ⅳ抑制劑會產(chǎn)生耐藥性和肝腎損傷等副作用[3]。生物活性肽是對生物機(jī)體生命活動有益或是具有生理作用的肽類化合物，是一類分子質(zhì)量小于6 000 Da，具有多種生物學(xué)功能的多肽[4]，其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不一，介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間，由2 個至數(shù)十個氨基酸通過肽鍵連接而成[5]。DPP-Ⅳ抑制活性肽主要來源于天然動植物，具有生物活性高、副作用低等優(yōu)點(diǎn)，在高效性和安全性等方面具有突出優(yōu)勢[6]，具有輔助控制血糖水平的潛力[7]。

近年來，已從豆類[7]、藜麥[8]、谷物[9]、油菜[10]、豬皮凝膠[11]、豬骨骼肌[12]、乳清蛋白[13]、酪蛋白[14]和駱駝乳[15]等中水解得到DPP-Ⅳ抑制肽。關(guān)于血液中DPP-Ⅳ抑制肽鮮有報道。血中富含血紅蛋白，血紅蛋白由2 個

α-亞基和2 個β-亞基組成，是一種非膜的復(fù)合變構(gòu)蛋白，能運(yùn)輸氧并調(diào)節(jié)血液酸堿平衡[16]，血紅蛋白酶解肽段具有抗氧化[17-18]、降血壓[19-20]和抗菌[21-22]等多種活性，且分子質(zhì)量小，可被直接吸收[23]，是一種非常有前途的功能性食品原料。生物信息學(xué)是用于管理、規(guī)劃和解釋與生物系統(tǒng)相關(guān)信息的計算方法，它利用各種數(shù)據(jù)庫、在線工具和軟件等獲取目標(biāo)功能。利用ExPASy Cutter[24]和BIOPEP[25]等在線平臺的肽剪切工具，可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列及特異蛋白酶的剪切位點(diǎn)在理論上預(yù)測肽的組成，并將肽段與數(shù)據(jù)庫中的DPP-Ⅳ多肽進(jìn)行比較[26]，從而選擇合適的底物及蛋白酶。

本研究以驢血紅蛋白為原料，通過借助ExPASy Cutter和BIOPEP在線平臺篩選合適的蛋白酶。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件制備驢血紅蛋白源DPP-Ⅳ抑制活性肽，為推動DPP-Ⅳ抑制活性肽產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)，以提高驢血的附加值，促進(jìn)驢產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇檢疫合格的3 歲烏公驢，在宰殺過程中收集新鮮血液，通過20 目篩后濾入含有1%檸檬酸鈉抗凝劑容器中。上述過程于內(nèi)蒙古呼和浩特市蒙驢食品定點(diǎn)屠宰場完成。

蛋白酶K（40 U/mg） 德國Merck公司;DPP-Ⅳ抑制劑篩選試劑盒 美國Abnova公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒 北京索來寶科技有限公司;氯化鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙醇、檸檬酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1真空冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;5804R高速冷凍離心機(jī) 艾本德（中國）有限公司;DK-8D水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PHS-3C雷磁pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;MULTISKAN GO全光譜酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司;凝膠成像儀、Mini protein II型垂直電泳系統(tǒng)? ?美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 驢血紅蛋白的提取及SDS-PAGE分析

采集新鮮驢血過20 目篩后，放入含有1%檸檬酸鈉抗凝劑容器中，5 000×g、4 ℃條件下離心5 min，去上層，按上述步驟重復(fù)3 次，收集紅細(xì)胞，置于4 ℃冰柜中保存?zhèn)溆?。將紅細(xì)胞中加入2 倍體積4 ℃預(yù)冷的去離子水，于4 ℃冰柜中靜置過夜后，12 000×g、4 ℃條件下離心20 min，去沉淀，收集上清液，即得驢血紅蛋白。采用SDS-PAGE檢測驢血紅蛋白純度，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、電壓110 V、電泳時間90 min。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后將膠片置于膠片觀察燈上觀察。

1.3.2 計算機(jī)模擬酶解驢血血紅蛋白

利用UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）獲得原料蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，由在線軟件PeptideCutter（http：//web.expasy.org/peptide_cutter/）進(jìn)行胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K模擬水解，將水解得到的多肽整理分類，與BIOPEP（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep）數(shù)據(jù)庫中的DPP-Ⅳ抑制肽進(jìn)行對比，篩選出合適的蛋白酶。

1.3.3 蛋白水解度的測定

在中性和堿性條件下，采用pH-Stat法[27]測定蛋白水解度。在水解反應(yīng)開始時，調(diào)節(jié)pH值為8.00，反應(yīng)結(jié)束后測定反應(yīng)體系pH值，用0.50 mol/L NaOH溶液將反應(yīng)體系pH值再次調(diào)至8.00，記錄所用NaOH溶液體積，

按式（1）計算蛋白水解度。

（1）

式中：V為NaOH溶液所用體積/mL;c為NaOH溶液濃度/（mol/L）;1/T為2.26;m為蛋白質(zhì)質(zhì)量/g;htot為每克蛋白質(zhì)中所含肽鍵的物質(zhì)的量（8.30 mmol/g）。

1.3.4 DPP-Ⅳ抑制活性測定

采用熒光法，按照DPP-Ⅳ抑制劑篩選試劑盒說明書步驟操作，37 ℃孵育30 min，在激發(fā)波長360 nm、發(fā)射波長460 nm條件下檢測熒光強(qiáng)度。按式（2）計算DPP-Ⅳ抑制率。

（2）

式中：a為抑制劑孔熒光強(qiáng)度;b為背景孔熒光強(qiáng)度;c為DPP-Ⅳ孔熒光強(qiáng)度。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

選定最佳蛋白酶后，研究酶解時間、酶解溫度和加酶量對驢血紅蛋白水解度和DPP-Ⅳ活性抑制率的影響。

1.3.5.1 酶解時間對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

設(shè)定底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、加酶量400 U/g、

酶解溫度60 ℃、pH 8，分別酶解1、2、3、4、5 h，以水解度和DPP-Ⅳ抑制率為指標(biāo)，確定最適酶解時間。

1.3.5.2 酶添加量對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

設(shè)定底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶解溫度60 ℃、pH 8、酶解時間3 h，分別考察加酶量為240、320、400、480、560 U/g時的水解度和DPP-Ⅳ抑制率，確定最適加酶量。

1.3.5.3 酶解溫度對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

設(shè)定底物質(zhì)量濃度1 g/100mL、蛋白酶K添加量480 U/g、pH 8、酶解時間3 h，分別考察酶解溫度50、55、60、65、70 ℃時的水解度和DPP-Ⅳ抑制率，確定最適酶解溫度。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化驢血紅蛋白制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的工藝條件

以DPP-Ⅳ抑制活性率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，采用3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，確定驢血紅蛋白制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳工藝條件。試驗(yàn)因素水平見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每項(xiàng)測定均重復(fù)3 次，采用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Design-Expert V8.0.6和SPSS 22軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 驢血紅蛋白純度檢測

由圖1可知，電泳只顯示一條蛋白質(zhì)條帶，說明該血紅蛋白的分子質(zhì)量均一，為典型的血紅蛋白SDS-PAGE圖像。

2.2 計算機(jī)模擬酶解驢血紅蛋白的結(jié)果

本研究分別使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K對驢血紅蛋白進(jìn)行模擬酶解。由表2可知，使用胰蛋白酶水解得到25 種多肽，共25 條，其中二肽4 種，共4 條，在總多肽數(shù)量中的占比為16%，四肽4 種，共4 條，在總多肽數(shù)量中的占比為16%。使用胃蛋白酶水解得到52 種多肽，共52 條，其中二肽15 種，共15 條，在總多肽數(shù)量中的占比為46.90%;三肽13 種，共13 條，在總多肽數(shù)量中的占比為40.60%。使用木瓜蛋白酶得到72 種多肽，共76 條，其中二肽27 種，共31 條，在總多肽數(shù)量中的占比為28.88%，三肽24 種，共24 條，在總多肽數(shù)量中的占比為25%;使用蛋白酶K水解得到76 種多肽，共78 條，其中二肽35 種，共37條，在總多肽數(shù)量中的占比為47.40%;三肽31 種，共31 條，在總多肽數(shù)量中的占比為39.70%。模擬水解的結(jié)果表明，蛋白酶K理論上釋放的肽段數(shù)量和種類較多，酶解效果優(yōu)于其他蛋白酶。

由表3可知，將模擬酶解得到的多肽與BIOPEP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K水解分別得到3、7、14、26 種已知的DPP-Ⅳ抑制活性肽。因此，本研究選用蛋白酶K作為最佳蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 酶解時間對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

小寫字母不同，表示水解度組間差異顯著（P<0.05）;大寫字母不同，表示DPP-Ⅳ抑制率組間差異顯著（P<0.05）。圖3～4同。

由圖2可知，在酶解1～3 h內(nèi)，驢血紅蛋白水解度呈遞增趨勢（P<0.05），隨著酶解時間的延長，水解度稍有降低;這是因?yàn)殡S著水解的進(jìn)行，底物蛋白質(zhì)不斷減少，酶解產(chǎn)物逐漸積累，從而抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行。DPP-Ⅳ抑制活性隨酶解時間的延長呈先上升后下降趨勢，在酶解3 h時達(dá)到最大，為54.75%，這與吉薇[28]使用動物蛋白酶水解南極磷蝦蛋白制備DPP-Ⅳ抑制肽的研究結(jié)果一致。這是因?yàn)殡S著酶解時間延長，蛋白質(zhì)水解生成的肽含量增多，DPP-Ⅳ抑制率隨之增大，繼續(xù)水解導(dǎo)致底物的酶解程度過大，使得到的活性多肽進(jìn)一步水解成氨基酸，多肽含量降低，活性肽的數(shù)量也隨之減少。

2.3.2 酶添加量對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

由圖3可知，酶添加量為240～480 U/g時，驢血紅蛋白水解度呈遞增趨勢（P<0.05），隨著酶添加量的增加，水解度變化幅度較小，曲線趨于平緩。抑制率DPP-Ⅳ隨酶添加量的增加呈先上升后下降趨勢，在480 U/g

時達(dá)到最大，為55.02%。這可能是因?yàn)槊柑砑恿枯^小時，隨著酶量的增多，蛋白質(zhì)分解逐漸完全，DPP-Ⅳ抑制率和水解度也逐漸增大。當(dāng)酶添加量達(dá)到480 U/g，此時酶分子相對于底物來說已趨向飽和，DPP-Ⅳ抑制率達(dá)到最大值，繼續(xù)增大酶添加量，蛋白分子水解完全導(dǎo)致具有DPP-Ⅳ抑制活性的多肽分子減少，DPP-Ⅳ抑制率降低，這與Nongonierma等[29]酶解制備DPP-Ⅳ抑制肽時的結(jié)論類似。

2.3.3 酶解溫度對驢血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制活性和水解度的影響

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，驢血紅蛋白水解度和酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制率均呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)酶解溫度為65 ℃時，二者均達(dá)到最大，繼續(xù)升高酶解溫度，DPP-Ⅳ抑制活性顯著下降（P<0.05）。推測隨著酶解溫度的升高，可能是由于蛋白酶K的結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變，從而影響酶解效果[30]，也可能是由于DPP-Ⅳ抑制肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化使其活性下降。因此，選擇65 ℃為最適酶解溫度。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

通過Design-Expert V8.0.6設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。得到回歸方程如下：Y=53.32+0.33A-0.20B+1.40C-1.72AB+1.33AC+1.60BC-2.32A2-5.10B2-2.76C2。對模型進(jìn)行方差分析，由表5可知，該模型P<0.01，失擬項(xiàng)P=0.2482>0.05，不顯著，表明建模成功，模型回歸系數(shù)R2=0.953 1，說明模型擬合程度良好且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，該模型可用于確定驢血紅蛋白制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳工藝。對DPP-Ⅳ抑制率影響順序?yàn)镃酶添加量>B酶解時間>A酶解溫度，模型中一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)AB、BC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P<0.05或P<0.01）。

2.4.1 因素交互作用分析

在響應(yīng)面分析中等高線形狀越接近橢圓形和響應(yīng)面曲面傾斜度越陡，響應(yīng)值對于處理?xiàng)l件改變的敏感程度越大，顏色越深，表明因素間的交互作用顯著，反之則交互作用不顯著[31]。由圖5可知，3 種因素交互作用對DPP-Ⅳ抑制率影響較顯著。

2.4.2 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

通過分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得到酶解驢血紅蛋白制備DPP-Ⅳ抑制活性肽的最佳條件為：底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶解時間3.15 h、酶解溫度65 ℃、pH 8.00、酶添加量400 U/g，此條件下2 mg/mL酶解產(chǎn)物對DPP-Ⅳ的抑制率為53.80%。在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證，測得此條件下DPP-Ⅳ抑制率為53.44%，接近于理論值，表明該模型可較好地反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

3 結(jié) 論

食源性DPP-Ⅳ抑制肽的研究一般按照以下流程

進(jìn)行[25，33]：1）選取合適的蛋白底物和酶;2）酶解蛋白;3）體外活性分析;4）富集/分離;5）DPP-Ⅳ抑制肽的鑒定;6）DPP-Ⅳ抑制效能驗(yàn)證;7）抑制機(jī)制闡述;8）細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該方法耗時且勞動強(qiáng)度大，對蛋白酶的選擇缺乏目的性[26]。本研究應(yīng)用計算機(jī)結(jié)合傳統(tǒng)酶解方法制備驢血紅蛋白源DPP-Ⅳ抑制活性肽，有效篩選出蛋白酶K為最佳蛋白酶，其水解所得多肽數(shù)量和種類最多，且獲得的已知的DPP-Ⅳ抑制活性肽數(shù)量也最多，有效地減少了實(shí)驗(yàn)過程中的盲目性。實(shí)際酶解結(jié)果表明，驢血紅蛋白酶解物具有一定的DPP-Ⅳ抑制活性;在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以DPP-Ⅳ抑制率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法研究酶解時間、酶解溫度和酶添加量對血紅蛋白酶解產(chǎn)物DPP-Ⅳ抑制率的影響，確定蛋白酶K的最優(yōu)酶解工藝為：底物質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶解時間3.15 h、酶解溫度65 ℃、pH 8.00、酶添加量400 U/g，此條件下2 mg/mL酶解產(chǎn)物對DPP-Ⅳ的抑制率為53.44%，理論值與實(shí)測值基本相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為驢血紅蛋白DPP-Ⅳ抑制肽的制備和功能性研究提供了技術(shù)參考。

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