膜聯(lián)蛋白A7及血管內(nèi)皮生長因子在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

佟力軍，王洪海

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)第二臨床學(xué)院(內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院) 病理科，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 022150；2.大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與法醫(yī)學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率位于女性惡性腫瘤的首位[1]。近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高趨勢，發(fā)病年齡趨于年輕化。目前，隨著我國居民健康意識的轉(zhuǎn)變及乳腺癌診斷、治療技術(shù)的提高，乳腺癌死亡率逐年下降。但值得注意的是，有部分乳腺癌患者治療后預(yù)后仍較差。研究表明，乳腺癌是一種異質(zhì)性的惡性腫瘤，不同患者臨床預(yù)后存在一定差別[2]。隨著精準醫(yī)學(xué)時代的到來，分析乳腺癌組織中不同分子表達情況及對患者預(yù)后的影響對于指導(dǎo)治療具有重要的意義。膜聯(lián)蛋白A7(annexin A7,ANXA7)是膜聯(lián)蛋白超家族的重要成員之一，有研究報道，ANXA7與胃癌、直腸癌、肝癌等發(fā)生有密切關(guān)系[3-5]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一類分布廣泛的細胞生長因子，具有促進血管和淋巴管生成的作用，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。但目前對于乳腺癌組織中ANXA7、VEGF的表達情況及兩者關(guān)系尚無定論。本研究探討ANXA7及VEGF在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義，旨在為乳腺癌的臨床診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月至2017年3月內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院收治的乳腺癌患者94例，納入標準：(1)所有患者均為初發(fā)、單側(cè)乳腺癌患者，并經(jīng)病理診斷為浸潤性導(dǎo)管癌；(2)接受手術(shù)治療，術(shù)后完成3年隨訪；(3)病歷資料完整，患者及家屬對研究知情同意。排除標準：(1)失訪患者；(2)三陰性乳腺癌患者；(3)合并其他系統(tǒng)腫瘤患者?；颊吣挲g35～78歲，平均年齡(50.26±5.63)歲；腫瘤直徑：≤2 cm 37例、>2 cm 57例；病理分級：Ⅰ級32例、Ⅱ級39例、Ⅲ級23例；TNM分期：Ⅰ期33例、Ⅱ期30例、Ⅲ期31例；有淋巴道轉(zhuǎn)移28例，無淋巴道轉(zhuǎn)移66例。標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，并經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)診。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理學(xué)審查同意。

1.2 方 法

所有患者手術(shù)中切取乳腺癌組織及距離腫瘤邊緣3 cm的癌旁組織，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片。應(yīng)用Roche Ventana Benchmark XT全自動免疫組化儀進行檢測，試劑為兔抗人ANXA7單克隆抗體、兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)單克隆抗體、兔抗人雌激素受體(estrogenreceptor,ER)單克隆抗體、兔抗人孕激素受體(progesteronereceptor,PR)單克隆抗體、免疫組化染色試劑盒、DAB顯色液，均為Roche公司生產(chǎn)的配套試劑。程序如下：76 ℃脫蠟4 min，緩沖液沖洗，37 ℃過氧化氫甲醇消化內(nèi)源性過氧化物酶4 min，緩沖液沖洗，pH值8.0～8.5的抗原修復(fù)緩沖液100 ℃抗原修復(fù)15 min，緩沖液沖洗，加入山羊血清封閉，加入生物學(xué)一抗37 ℃下12 min，生物學(xué)二抗37 ℃下8 min，緩沖液沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、返藍、取出完成的玻片，常規(guī)酒精脫水、透明、中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察，用PBS代替生物學(xué)一抗作陰性對照，用說明書配套陽性樣本作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判定

根據(jù)顯色程度及陽性細胞所占比例進行評分[7]：標本無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。再將兩項積分乘積得總積分：總積分 0～3分為(-)；總積分4～5分為(+)；總積分6～7分為(++)，總積分8分以上為(+++)。(+)～(+++)判定為陽性。

1.4 隨 訪

所有患者隨訪3年，隨訪時間至2020年3月結(jié)束。觀察患者復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率，根據(jù)情況分為復(fù)發(fā)組、未復(fù)發(fā)組；遠處轉(zhuǎn)移組、無遠處轉(zhuǎn)移組。

1.5 臨床病理參數(shù)分析

分析不同年齡、腫瘤大小、病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2、ER、PR表達情況、復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移情況患者乳腺癌組織中ANXA7、VEGF陽性表達情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中ANXA7、VEGF蛋白表達情況

乳腺癌組織ANXA7、VEGF陽性率顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 乳腺癌組織及癌旁組織中ANXA7及VEGF的表達 [n(%)]

A:乳腺癌組織中ANXA7表達(+++)；B:乳腺癌旁組織中ANXA7表達(-)；C:乳腺癌組織中VEGF表達(+++)；D:乳腺癌旁組織中VEGF表達(-)圖1 免疫組織化學(xué)法檢測ANXA7、VEGF在乳腺癌組織中的表達(×400)Fig.1 Expression of ANXA7,VEGF in breast cancer tissues was detected by immunohistochemistry (×400)

2.2 ANXA7、VEGF蛋白在乳腺癌組織中表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

乳腺癌組織中不同年齡、腫瘤大小、ER、PR表達情況ANXA7、VEGF陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨病理分級升高乳腺癌組織中ANXA7陽性率升高，VEGF陽性率升高，TNM Ⅲ期、HER-2陽性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織ANXA7、VEGF陽性率顯著高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、HER-2陰性、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織(P<0.05)。見表2。

所有患者完成3年隨訪，復(fù)發(fā)15例，復(fù)發(fā)率15.96%，遠處轉(zhuǎn)移9例，遠處轉(zhuǎn)移率9.57%。復(fù)發(fā)組ANXA7陽性率顯著高于未復(fù)發(fā)組，遠處轉(zhuǎn)移組ANXA7陽性率顯著高于未轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；復(fù)發(fā)組VEGF陽性率與未復(fù)發(fā)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，遠處轉(zhuǎn)移組VEGF陽性率與無遠處轉(zhuǎn)移組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 ANXA7、VEGF蛋白在乳腺癌組織中表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.3 乳腺癌組織中ANXA7蛋白與VEGF蛋白表達的相關(guān)性

ANXA7蛋白陽性乳腺癌組織中VEGF蛋白陽性率顯著高于ANXA7蛋白陰性乳腺癌組織(P<0.05)，見表3。Spearman相關(guān)分析顯示，乳腺癌組織中ANXA7蛋白表達與VEGF蛋白表達呈正相關(guān)(rs=0.211，P=0.041)。

3 討 論

ANXA7又稱為會連蛋白，最初是從牛腎上腺髓質(zhì)中分離出來，是細胞內(nèi)含量最為豐富的蛋白質(zhì)之一[8]。人類ANXA7基因位于染色體10q21，其編碼蛋白質(zhì)具有Ca2+依賴的膜融合活性，可以促進膜融合、黏附、聚集、運輸?shù)萚9-10]。研究表明，ANXA7還可以激活GTP酶，通過介導(dǎo)Ca2+/GTP信號通路，影響細胞的增殖與分化[11]。已有研究報道，在多種惡性腫瘤組織中存在ANXA7表達增高[12-13]。田煥娜等[14]報道，下調(diào)ANXA7可以促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡，抑制腫瘤增殖，并認為ANXA7 可以促進乳腺癌發(fā)生。Wang XY等[15]報道ANXA7可以調(diào)節(jié)腫瘤淋巴管生成，促進淋巴道轉(zhuǎn)移。眾所周知，惡性腫瘤的生長與血管生成有密切關(guān)系，腫瘤細胞的增殖迅速，需要豐富的血管為其分裂、增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移提供物質(zhì)基礎(chǔ)。VEGF是目前已知的最重要的促進血管形成的細胞因子，具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管形成的作用[16]。

表3 不同VEGF表達情況乳腺癌組織中ANXA7表達情況 [n(%)]

我們通過對94例乳腺癌及其癌旁組織中ANXA7蛋白及VEGF蛋白表達情況的檢測分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中ANXA7、VEGF蛋白陽性率顯著高于癌旁組織，該結(jié)果與田煥娜的研究結(jié)果相符，表明ANXA7高表達與乳腺癌的發(fā)生有密切關(guān)系，分析ANXA7高表達可能通過抑制乳腺細胞凋亡、促進乳腺細胞惡性增殖，進而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。而VEGF蛋白高表達則與乳腺細胞惡性增殖、腫瘤周圍血管及淋巴管生成增加有關(guān)[17]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，隨TNM分期升高，乳腺癌組織中ANXA7、VEGF蛋白陽性率升高，病理分級Ⅲ級、HER-2陽性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織ANXA7、VEGF蛋白陽性率顯著高于病理分級Ⅰ～Ⅱ級、HER-2陰性、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織，推測ANXA7、VEGF可能與乳腺癌患者病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。HER-2是一類原癌基因，其表達蛋白是一種跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶活性[18]。研究表明，HER-2參與腫瘤的增殖、分化和凋亡，其表達情況與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)，已成為指導(dǎo)乳腺癌治療及判斷預(yù)后的重要指標[19]。本研究結(jié)果顯示HER-2陽性乳腺癌組織ANXA7、VEGF蛋白陽性率顯著高于HER-2陰性乳腺癌組織，同時乳腺癌組織中ANXA7蛋白表達與VEGF蛋白表達呈正相關(guān)。推測HER-2可能與ANXA7、VEGF具有某種信號關(guān)聯(lián)，發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，其具體機制有待于進一步研究證實。淋巴轉(zhuǎn)移是乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要方式。既往有報道顯示VEGF可以調(diào)節(jié)腫瘤淋巴管生成，促進乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移[20]。而Wang J等[21]報道，ANXA7可以促進諸如肝細胞癌等上皮細胞腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移。我們結(jié)果也表明ANXA7、VEGF與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，為腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機制研究提供了依據(jù)。

本研究對患者進行了3年隨訪，并對患者預(yù)后進行了比較，結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組ANXA7陽性率顯著高于未復(fù)發(fā)組，遠處轉(zhuǎn)移組ANXA7陽性率顯著高于未轉(zhuǎn)移組。分析其原因可能與ANXA7可以促進腫瘤淋巴管生成，從而促進淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。而復(fù)發(fā)組VEGF陽性率與未復(fù)發(fā)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，遠處轉(zhuǎn)移組VEGF陽性率與無遠處轉(zhuǎn)移組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，則表明VEGF與乳腺患者近期預(yù)后無關(guān)，也可能與本研究中VEGF陰性組病例數(shù)較少有關(guān)。提示ANXA7可以對乳腺癌患者的預(yù)后判斷提供依據(jù)，也可對乳腺癌藥物治療提供研究方向。同時本研究也存在一定不足，我們的研究僅側(cè)重于ANXA7、VEGF與患者臨床病理特征及預(yù)后的分析，未涉及分子機制的研究，仍有待于今后進一步研究分析乳腺癌的分子生物學(xué)特征。

綜上所述，乳腺癌組織中存在ANXA7、VEGF蛋白表達增高，兩者在乳腺癌中表達呈正相關(guān)，ANXA7蛋白對乳腺癌的病理分級、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后判斷具有一定價值，VEGF對乳腺癌的病理分級、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移的輔助判斷具有一定價值。