高效液相色譜法測(cè)安徽產(chǎn)地茶葉中咖啡因的含量*

王船英 邾枝花 季婷婷 許玉芳

安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，安徽 合肥 230601

茶葉，山茶科植物茶Camellia sinensis（Linn．）O．Katze的干燥嫩葉。嫩枝無(wú)毛。葉革質(zhì)，長(zhǎng)圓形或橢圓形，先端鈍或尖銳，基部楔形，上面發(fā)亮，下面無(wú)毛或初時(shí)有柔毛，邊緣有鋸齒，葉柄無(wú)毛。茶葉是中國(guó)傳統(tǒng)飲品，入口澀，回味甘。茶葉中含有兒茶素、茶多酚、茶多糖、咖啡因等多種有益成分，各種成分均有不同的保健功效。［1?3］咖啡因（C8H10N4O2），弱堿性化合物，作為茶葉中的一種重要成分，咖啡因具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)新陳代謝、消除疲勞、增加心臟和胃腸道功能的作用。［4?6］近年來(lái)研究顯示，咖啡因可以預(yù)防阿爾茨海默病、早產(chǎn)兒支氣管肺炎，適當(dāng)飲用還可以降低肥胖、糖尿病和腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此研究茶葉中咖啡因的含量，可以合理利用茶葉的保健功能［7］。?

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1儀器 高效液相色譜儀（Waters 1525?2489）；色譜柱（C18，5μm×4．6 mm×250 mm，大連依利特）；超聲清洗儀（UP?2200H型）；萬(wàn)分之一電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；AT?330柱溫箱；電加熱套；索氏提取裝置；蒸餾裝置；蒸發(fā)皿；熔點(diǎn)測(cè)定儀（北京科儀電光儀器，XT4B型）等。

1.1.2材料與試劑 茶葉（5批安徽不同產(chǎn)地市售茶葉，產(chǎn)地分別為黃山、霍山、桐城、岳西、六安）；咖啡因?qū)φ掌罚▽?shí)驗(yàn)室自制）；氧化鈣（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；95%乙醇（分析純）；甲醇（色譜純）；純化水；0．45μm有機(jī)濾膜。

1.2 溶液的配制

1.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

1.2.1.1 對(duì)照品的提取精制 稱(chēng)取適量茶葉末，置于濾紙?zhí)淄仓校?50 ml圓底燒瓶中加入90 ml 95%乙醇，沸石5～6粒，利用索氏提取器裝置連續(xù)回流1～2 h，回流液經(jīng)蒸餾裝置蒸餾濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加入氧化鈣3～4 g，沸水浴濃縮至黏稠，隔石棉網(wǎng)酒精燈加熱，焙炒至干燥。用扎滿(mǎn)小孔的濾紙蓋在蒸發(fā)皿上，倒扣上普通玻璃漏斗，漏斗頸塞上脫脂棉，繼續(xù)小火加熱升華，至出現(xiàn)棕色煙霧，停止加熱。收集濾紙上和漏斗壁上的晶體，晶體呈白色針狀。［8-9］

1.2.1.2 咖啡因?qū)φ掌返蔫b別 取1.2.1.1項(xiàng)所得的晶體適量進(jìn)行毛細(xì)管裝樣，將待測(cè)毛細(xì)管置于熔點(diǎn)測(cè)定儀中進(jìn)行檢測(cè)，得到所裝樣品的熔點(diǎn)為236.7～237.4℃。［10］熔點(diǎn)與咖啡因藥典標(biāo)準(zhǔn)2010版一致。

1.2.1.3 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取實(shí)驗(yàn)室自制的咖啡因?qū)φ掌?.0050 g，用甲醇溶解定容至50m l容量瓶中，制得對(duì)照品溶液濃度為1 mg·ml-1，備用。

1.2.2 茶葉樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取茶葉末1g，置于濾紙?zhí)淄仓?，圓底燒瓶中加70 ml 95%乙醇，利用索氏提取裝置連續(xù)回流1.5 h后，將回流液用95%乙醇定容至100 m l容量瓶中。再?gòu)闹形? ml溶液用純化水定容至5 ml容量瓶中，即得。5批樣品溶液均用此方法制得。

1.3 色譜條件

色譜柱為C18(5μm×4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為甲醇∶純化水=(40∶60);流速為1ml·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm［11-13］;柱溫為室溫;進(jìn)樣體積為20μl，所有進(jìn)樣溶液均經(jīng)過(guò)0.45μm的微孔濾膜濾過(guò)。

1.4 線性關(guān)系考察

精密吸取1.2.1項(xiàng)的對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成0.1 mg·m l-1、0.25 mg·ml-1、0.5 mg·ml-1、0.75 mg·ml-1不同濃度的對(duì)照品溶液。分別吸取過(guò)濾后的該5種不同濃度的對(duì)照品溶液20μl，注入色譜儀。以峰面積Y為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣濃度X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=3×107X+673529，R2=0.999。結(jié)果表明，咖啡因在2～20μg之間，其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖1。咖啡因?qū)φ掌飞V圖見(jiàn)圖2所示。

圖1 咖啡因?qū)φ掌肪€性關(guān)系

圖2 咖啡因?qū)φ掌稨PLC圖譜

1.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取1.2.1項(xiàng)下已配制的1 mg.ml-1的咖啡因?qū)φ掌啡芤?0μl，連續(xù)6次進(jìn)樣，得到咖啡因的峰面積。6次峰面積見(jiàn)表1所示。經(jīng)過(guò)計(jì)算，其RSD值為0.16%，說(shuō)明儀器精密度良好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)

1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

吸取1.2.2項(xiàng)已配制的霍山產(chǎn)茶葉溶液6次分別進(jìn)樣，每次20μl，檢測(cè)后咖啡因的峰面積見(jiàn)表2所示。經(jīng)計(jì)算，其RSD值為1.9%，說(shuō)明該方法重復(fù)性好。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取1.2.2項(xiàng)下黃山產(chǎn)茶葉溶液20μl，在1.3項(xiàng)色譜條件下，在放置0、4、8、12、24 h測(cè)定咖啡因峰面積見(jiàn)表3所示，并計(jì)算出RSD值為1.3%。說(shuō)明待測(cè)樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2含量測(cè)定

精密稱(chēng)取5個(gè)產(chǎn)地茶葉，每份1 g，按1.2.2項(xiàng)方法制取樣品溶液。過(guò)0.45μm微孔濾膜，待測(cè)。吸取每份溶液20μl進(jìn)樣。每份溶液各進(jìn)兩針。樣品溶液的液相色譜圖見(jiàn)圖3。5份溶液共10次所測(cè)咖啡因峰面積見(jiàn)表4所示。

圖3 茶葉樣品溶液HPLC圖譜

表4 5產(chǎn)地茶葉中咖啡因的含量

3結(jié)論

運(yùn)用該實(shí)驗(yàn)方法對(duì)各產(chǎn)地茶葉中提取的咖啡因進(jìn)行檢查，結(jié)果表明:5批不同產(chǎn)地的茶葉中，咖啡因含量均不相同，但都不低于5%。其中六安產(chǎn)地茶葉含量最高為6.9%。整個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，出峰快，操作過(guò)程靈活便捷，專(zhuān)屬性強(qiáng)。此方法適合用于測(cè)定茶葉中咖啡因的含量。