補(bǔ)腎調(diào)肝方對卵巢儲備功能下降大鼠卵巢/海馬功能及PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

劉柳青 劉雁峰 潘雪 許夢白 吳豆豆 楊綠

卵巢儲備功能下降(diminished ovarian reserve，DOR)是指卵巢內(nèi)存留的、可募集的卵泡數(shù)量減少和(或)卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，可引起流產(chǎn)率升高[1]和輔助生殖妊娠不良結(jié)局[2]。近年來，精神心理因素在DOR發(fā)病中的作用逐漸受到重視。研究證實(shí)，社會心理因素會引起慢性心理應(yīng)激、造成DOR[3-5]，而DOR患者亦常伴有焦慮、抑郁等情緒[6]。從中醫(yī)角度看，本病以腎虛為基本病機(jī)，與肝、脾、腎等臟腑密切相關(guān)，腎虛肝郁是DOR的重要病機(jī)和常見證型[4,7]。

本團(tuán)隊(duì)通過前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，采取補(bǔ)腎調(diào)肝方治療DOR可取得較好療效，在改善DOR患者卵巢功能、伴隨癥狀及生存質(zhì)量等方面效果顯著[8]，但其作用靶點(diǎn)及起效機(jī)制尚不清楚。因此，本研究立足DOR患者生殖能力下降與慢性心理應(yīng)激狀態(tài)并存的臨床特征，建立DOR合并慢性心理應(yīng)激大鼠模型，基于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K),蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyclin,mTOR)的PI3K/AKT/mTOR信號通路，從卵巢儲備和神經(jīng)內(nèi)分泌兩個(gè)角度，探討補(bǔ)腎調(diào)肝方改善卵巢、海馬功能的作用靶點(diǎn)和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級大鼠60只，雌性，7周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-0006]。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，每日常規(guī)查看陰道涂片以觀察大鼠的動情周期。將49只具備連續(xù)兩個(gè)正常動情周期(4～5天)的大鼠納入正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 倫理審查

實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：BUCM-4-2019022803-1033。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

雷公藤多苷片，10 mg/片，湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號：20190603。戊酸雌二醇片，1 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號：555A。地屈孕酮片，10 mg/片，Abbott Biologicals B.V.(荷蘭)，批準(zhǔn)文號：H20170221。補(bǔ)腎調(diào)肝方(配方顆粒)：熟地黃15 g、黃精15 g、枸杞子15 g、桑寄生15 g、郁金12 g、丹參20 g、鱉甲20 g、葛根10 g。由東直門醫(yī)院免煎顆粒室提供，北京康仁堂藥業(yè)統(tǒng)一制備，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

大鼠五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)ELISA試劑盒(武漢基因美科技有限公司)、大鼠多巴胺(dopamine,DA)ELISA試劑盒(武漢基因美科技有限公司)，抗PI3K p85抗體(CST 貨號4257T)，抗p-PI3K p85抗體(abcam 貨號ab182651)，抗AKT抗體(CST 貨號9272S)，抗p-AKT抗體(CST 貨號4060S)，抗mTOR(Bioworld 貨號BS3611)，抗p-mTOR抗體(CST 貨號5536T)等。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動物分組 按隨機(jī)數(shù)字表將49只大鼠隨機(jī)分為2組，分別為空白對照組(12只)、造模組(37只)。

1.5.2 DOR合并慢性心理應(yīng)激大鼠模型的建立 本實(shí)驗(yàn)采用慢性不可預(yù)知溫和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)聯(lián)合雷公藤多苷片法進(jìn)行造模。CUMS法參照Willner[9]并加以改進(jìn)[10]，包含8種不同刺激類型：禁水(24小時(shí))、禁食(24小時(shí))、潮濕墊料(將200mL水加入有鋸末的籠底，24小時(shí))、傾斜(24小時(shí))、束縛(3小時(shí))、電擊(10 s/次×6次，每次2.5 mA)、夾尾(1分鐘)、冰水游泳(5分鐘)。每日隨機(jī)給予1種刺激。

雷公藤多苷片法從造模第15天起實(shí)施。給予雷公藤多苷片混懸液灌胃，劑量為75 mg/kg/d，連續(xù)灌胃14天，每日一次?？瞻讓φ战M正常喂養(yǎng)，并予等量去離子水灌胃。

造模過程中，3只造模組大鼠死亡(冰水游泳死亡2只，束縛死亡1只)。

造模完成后，所有動物進(jìn)行曠場試驗(yàn)。隨后空白對照組隨機(jī)抽取6只、造模組隨機(jī)抽取5只處于動情間期或動情前期的大鼠，1%戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈取血置于加入促凝劑的采血管；取雙側(cè)卵巢組織，置于4%甲醛溶液中固定；取海馬組織，置于凍存管內(nèi)，于液氮中速凍待測。

1.5.3 給藥方法 利用隨機(jī)數(shù)字表，將造模組剩余29只大鼠隨機(jī)分為5組：模型組(5只)、西藥組(6只)、中藥低劑量組(6只)、中藥中劑量組(6只)、中藥高劑量組(6只)?？瞻讓φ战M剩余6只大鼠與模型組大鼠予普通飼料正常喂養(yǎng)。西藥組予激素補(bǔ)充治療方案治療4個(gè)動情周期，第1～5天每日予戊酸雌二醇片溶液灌胃，劑量為0.105 mg/kg/d，第4～5天加用地屈孕酮片2.1 mg/kg/d。第6～10天、第11～15天、第16～20天重復(fù)第1～5天的給藥方案。中藥低、中、高劑量組分別予配制好的低、中、高濃度的中藥顆粒劑溶液灌胃。按照人常用劑量(26 g/d)為等效劑量，經(jīng)等效體表面積公式[11]換算，中藥高、中、低劑量分別為：5.46 g/kg/d、2.73g /kg/d、1.365 g/kg/d。給藥治療期間，模型組及各治療組仍予CUMS。給藥完成后，進(jìn)行曠場試驗(yàn)，后采用上述方法麻醉、取材，固定、凍存卵巢組織，凍存海馬組織。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 曠場試驗(yàn) 所有大鼠分別于造模后、治療后進(jìn)行。每只大鼠單獨(dú)測試。測試前至少12小時(shí)未接收外界應(yīng)激。自制無蓋方形敞箱，60 cm×100 cm×100 cm，底部均分為25個(gè)小方格。將大鼠從尾根部1/3處提起，輕輕放入敞箱正中格，使其自由活動3分鐘，計(jì)算其水平穿格及垂直活動次數(shù)。測試完成后，用75%乙醇溶液清洗敞箱，防止遺留大鼠信息影響下次測試結(jié)果。

1.6.2 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)中性福爾馬林溶液固定的卵巢組織行梯度乙醇脫水，之后二甲苯透明，浸蠟，包埋成蠟塊，切成4 μm厚的切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后使用中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察、記錄并拍照。

1.6.3 海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)檢測 將凍存海馬組織制備成組織勻漿，采取酶聯(lián)免疫吸附法檢測治療前后5-HT、DA水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)量 分別取0.1 g大鼠卵巢、海馬組織加入1 mL RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行組織裂解，離心后收集總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)制膠、上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜。于次日使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5小時(shí)。隨后使用ECL發(fā)光試劑盒曝光顯影，使用Image J軟件進(jìn)行膠片條帶的半定量分析。

1.6.5 qRT-PCR法檢測PI3K、AKT、mTOR的mRNA含量 分別使用1μg大鼠卵巢、海馬總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，進(jìn)行熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)。以β-actin為內(nèi)部參照，引物濃度為1 μmol/L，cDNA使用1 μL，反應(yīng)條件按照說明書采用兩步法進(jìn)行，95℃預(yù)變性1分鐘，95℃變性20秒，60℃退火延伸1分鐘，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，所得CT值按照2-△△Ct方法進(jìn)行均一化處理后再進(jìn)行mRNA相對含量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。內(nèi)參及引物見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)變化

造模后，造模組水平穿格次數(shù)和垂直活動次數(shù)均明顯小于對照組(P<0.05)。給藥20天后，模型組的活動情況仍明顯差于空白對照組，各治療組與模型組相比均有不同程度的升高；其中，中藥高劑量組在水平穿格次數(shù)上明顯高于模型組(P<0.01)。結(jié)果見表2、表3。

表2 造模后空白對照組與造模組曠場試驗(yàn)情況

表3 治療后各組曠場試驗(yàn)情況

2.2 卵巢組織病理變化

造模后，空白對照組可見較多大小不等各期卵泡，顆粒細(xì)胞排列有序、發(fā)育良好，卵巢見較多黃體和血管；模型組可見較多擴(kuò)張的閉鎖卵泡，卵泡形態(tài)不佳，部分顆粒細(xì)胞層排列紊亂、層數(shù)減少，黃體和血管明顯減少，提示DOR造模成功，見圖1。

注：A:空白對照組；B:造模組。

治療后，空白對照組與造模后對照組表現(xiàn)一致；模型組仍可見較多閉鎖卵泡，以及少量黃體、血管、發(fā)育中卵泡；西藥組可見成熟卵泡，黃體及血管豐富，有部分閉鎖卵泡；中藥各組可見較多大小不等各期卵泡，顆粒細(xì)胞排列有序，見圖2。與模型組相比，治療組閉鎖卵泡數(shù)量明顯減少，同時(shí)可見較多黃體和血管；與西藥組相比，中、高劑量組可見較多初級卵泡、次級卵泡。

2.3 海馬神經(jīng)遞質(zhì)變化

造模后，模型組5-HT、DA水平較空白對照組明顯下降(P<0.01)。給藥后，未經(jīng)治療的模型組5-HT、DA仍低于對照組(P<0.01)；而各治療組5-HT、DA水平明顯高于模型組(P<0.01)；中藥各組中，神經(jīng)遞質(zhì)水平隨著中藥濃度的增加而升高；其中，中藥高劑量組的5-HT水平顯著高于西藥組(P<0.01)。見表4、表5。

注：A:對照組；B:模型組；C:中藥高劑量組；D:中藥中劑量組；E:中藥低劑量組；F:西藥組。

表4 造模后對照組與模型組神經(jīng)遞質(zhì)濃度

表5 治療后各組神經(jīng)遞質(zhì)濃度

bP<0.01；與同一時(shí)期西藥組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.4 PI3K/AKT/mTOR信號通路在卵巢、海馬組織中的變化情況

2.4.1 PI3K/AKT/mTOR信號通路在卵巢組織中的變化情況 模型組大鼠卵巢組織PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)及活化均明顯低于對照組(P<0.01)。治療后各蛋白表達(dá)及活化均較模型組有所增加。其中，中藥高劑量組的AKT表達(dá)較模型組顯著改善(P<0.01)；各治療組中PI3K、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)較模型組均顯著改善(P<0.01)，且在中藥各組中，其相對表達(dá)量隨著中藥給藥濃度的增加而增加，在中藥高劑量組，其表達(dá)量均明顯高于西藥組(P<0.01)。結(jié)果見表6、表7、圖3。

表7 各組大鼠卵巢組織中AKT相對表達(dá)量M(P25-P75)

圖3 各組大鼠卵巢組織中PI3K/AKT/mTOR蛋白及 其磷酸化產(chǎn)物免疫印跡條帶圖

表6 各組大鼠卵巢組織中PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、pAKT、mTOR相對表達(dá)量

模型組大鼠卵巢組織中PI3K mRNA、AKT mRNA和mTOR mRNA的相對含量均顯著低于對照組(P<0.01)。治療后，各指標(biāo)均有所改善。其中，中藥高劑量組和西藥組中的PI3K mRNA含量顯著高于模型組(P<0.01)；各治療組中AKT mRNA、mTOR mRNA含量均顯著高于模型組(P<0.01)，且在中藥治療組中，其含量隨著中藥給藥濃度的增加而增加，在中藥高劑量組其含量均顯著高于西藥組(P<0.01)。見表8、表9。

表8 各組大鼠卵巢組織中AKT mRNA、 mTOR mRNA相對含量

表9 各組大鼠卵巢組織中PI3K mRNA 相對含量M(P25-P75)

2.4.2 PI3K/AKT/mTOR信號通路在海馬組織中的變化情況 模型組大鼠海馬組織中PI3K、AKT、mTOR蛋白表達(dá)及活化均顯著低于對照組(P<0.01)。治療后，各蛋白表達(dá)及活化情況均有所改善。其中，中藥高劑量組p-PI3K、p-AKT的表達(dá)均顯著高于模型組(P<0.01)；各治療組中PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR的表達(dá)均較模型組顯著增加(P<0.01)，且在中藥各組中，其表達(dá)量隨著中藥給藥濃度的增加而增加，在中藥高劑量組其表達(dá)均高于西藥組(P<0.01)。見表10、表11、圖4。

表11 各組大鼠海馬組織中p-PI3K、 p-AKT相對表達(dá)量M(P25-P75)

圖4 各組大鼠海馬組織中PI3K/AKT/mTOR蛋白 及其磷酸化產(chǎn)物免疫印跡條帶圖

模型組大鼠海馬組織中PI3K mRNA、AKT mRNA和mTOR mRNA的相對含量均顯著低于對照組(P<0.01)。治療后，各指標(biāo)均有所改善。其中，在中藥高劑量組和西藥組的PI3K mRNA、AKT mRNA含量顯著高于模型組(P<0.01)；各治療組的mTOR mRNA含量均較模型組顯著改善(P<0.01)，且在中藥治療組中，其含量隨中藥給藥劑量的增加而增加，在中藥高劑量組顯著高于西藥組(P<0.01)。見表12、表13。

表10 各組大鼠海馬組織中PI3K、AKT、mTOR、mTOR相對表達(dá)量

表12 各組大鼠海馬組織中PI3K mRNA、 AKT mRNA相對含量M(P25-P75)

表13 各組大鼠海馬組織中mTOR mRNA相對含量

3 討論

3.1 DOR合并慢性心理應(yīng)激大鼠模型的建立

本研究采取雷公藤多苷片聯(lián)合CUMS法造模。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，雷公藤多苷具有生殖毒性，常用于誘導(dǎo)卵巢功能下降的動物模型[12-14]，且模型符合中醫(yī)腎虛證特點(diǎn)[15-16]。CUMS法是國際通用的抑郁癥造模方法[17-18]，可造成慢性心理應(yīng)激，引起類似肝郁證的行為學(xué)及交感神經(jīng)遞質(zhì)改變[19-20]?？紤]到臨床上很多DOR患者伴有慢性心理應(yīng)激狀態(tài)，本研究團(tuán)隊(duì)采取二者聯(lián)合的方式誘導(dǎo)DOR合并慢性心理應(yīng)激動物模型，以求動物模型的疾病狀態(tài)更加貼近臨床實(shí)際。

通過實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷片聯(lián)合CUMS能夠建立合并慢性心理應(yīng)激的DOR大鼠模型，可在一定程度上反映本病的臨床特征。雷公藤多苷片誘導(dǎo)DOR大鼠模型在停止造模后有一定的自愈傾向，但在20天內(nèi)恢復(fù)程度較小。因此，該模型可用于藥效和機(jī)制的研究。

3.2 補(bǔ)腎調(diào)肝方改善卵巢儲備功能、慢性心理應(yīng)激狀態(tài)

補(bǔ)腎調(diào)肝方是筆者劉雁峰治療DOR的經(jīng)驗(yàn)方。本方立足于腎虛肝郁病機(jī)，以熟地黃、黃精、枸杞子溫補(bǔ)腎肝精血，桑寄生充養(yǎng)腎氣，兼以郁金解郁行氣，丹參活血通絡(luò)，鱉甲滋陰潛陽，葛根升舉清陽。本方以補(bǔ)益腎肝精血為基礎(chǔ)，又參以活血通絡(luò)、升清潛陽之品，全面調(diào)理DOR患者的氣血陰陽，使精充血足、氣血和調(diào)，從而發(fā)揮改善卵巢功能和精神情志的臨床效果。

在本次實(shí)驗(yàn)中，本方體現(xiàn)了糾正大鼠抑郁行為的作用，該作用可能與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)；亦能夠增加DOR大鼠卵巢中的卵泡、黃體和血管，且中、高劑量組可見更多的初級卵泡、次級卵泡，提示其對卵巢儲備的改善作用可能與促進(jìn)原始卵泡的生長發(fā)育有關(guān)，未來可選擇與原始卵泡發(fā)育相關(guān)的指標(biāo)開展進(jìn)一步的深入研究。

3.3 補(bǔ)腎調(diào)肝方調(diào)節(jié)DOR大鼠PI3K/AKT/mTOR信號通路

PI3K/AKT/mTOR信號通路主要由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)3個(gè)作用分子組成，是參與調(diào)控細(xì)胞增殖、代謝、凋亡等一系列生命現(xiàn)象的經(jīng)典通路，與始基卵泡的募集和消耗、卵泡的發(fā)育及卵巢功能的調(diào)控關(guān)系密切[21-23]。海馬中的PI3K/AKT通路可促進(jìn)血管新生、改善海馬血液循環(huán)[24]；而AKT/mTOR通路的激活、AKT和mTOR等關(guān)鍵蛋白表達(dá)的上調(diào)，可發(fā)揮抗抑郁作用[25-26]。故本研究選擇PI3K/AKT/mTOR信號通路，以探討補(bǔ)腎調(diào)肝方改善卵巢功能和慢性心理應(yīng)激狀態(tài)的分子生物學(xué)機(jī)制。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎調(diào)肝方能夠在卵巢組織和海馬組織發(fā)揮調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路的作用，糾正病理狀態(tài)下通路表達(dá)、活化的抑制狀態(tài)，且該作用的實(shí)現(xiàn)可能與上調(diào)相應(yīng)蛋白mRNA的表達(dá)有關(guān)。這一結(jié)果也提示，補(bǔ)腎調(diào)肝方可同時(shí)調(diào)節(jié)卵巢、海馬組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路的表達(dá)與活化，這可能是本方同時(shí)改善卵巢功能和心理應(yīng)激狀態(tài)、實(shí)現(xiàn)中藥腎肝同調(diào)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

本研究初步觀察了補(bǔ)腎調(diào)肝方對大鼠卵巢功能及心理應(yīng)激狀態(tài)的改善作用，以及對PI3K/AKT/mTOR信號通路的調(diào)節(jié)情況，發(fā)現(xiàn)本方能夠有效改善卵巢儲備功能和慢性心理應(yīng)激狀態(tài)，其作用機(jī)制可能與上調(diào)卵巢和海馬中PI3K/AKT/mTOR信號通路有關(guān)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，購入的大鼠中存在一定數(shù)量不具正常動情周期者無法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以后將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，優(yōu)化CUMS法的實(shí)施細(xì)節(jié)，細(xì)化觀測指標(biāo)，開展更深入的研究。