固本抑瘤Ⅱ號對乳腺癌小鼠RECQL4蛋白和mRNA表達的影響

徐曉華 劉敏 李可欣 張青

據(jù)GLOBOCAN 癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2018年全球乳腺癌新發(fā)病例為2088849，死亡病例為626679，其發(fā)病率(11.6%)和死亡率(6.6%)位居女性首位[1]。盡管目前有放療、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療等多種治療手段，但仍無法完全根治此病，尋找更有效的治療方法是目前乳腺癌治療亟待解決的問題。

RECQL4屬于RECQ解旋酶家族(WRN，BLM，RECQL4，RECQL1和RECQL5)之一，存在于端粒和線粒體，具有解旋酶活性[2]，是正常細胞和癌細胞DNA復(fù)制起始因子之一，可以參與維持基因組穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)相互作用[3]。RECQL4 基因C端區(qū)域突變可導(dǎo)致具有癌癥易患性的Rothmund-Thomson綜合征[4]，此外，RECQL4蛋白和/或mRNA也可在乳腺癌[5]、胃癌[6]、肝癌[7]、前列腺癌[8]、骨肉瘤[9]等多種腫瘤中過表達，且多與預(yù)后不良相關(guān)。故本研究以固本抑瘤Ⅱ號為主，通過體內(nèi)實驗觀察其療效，并探索其與RECQL4表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細胞及實驗動物

4T1-熒光素酶標(biāo)記(4T1-luc)小鼠乳腺癌細胞來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室。SPF級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重20±2 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。小鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部，獨立通風(fēng)籠(IVC)環(huán)境中。本研究已通過首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(AEEI-2018-089)。

1.2 試劑及儀器

固本抑瘤Ⅱ號由生黃芪(13.45%)、黨參(6.73%)、女貞子(6.73%)、茯苓(4.48%)、生白術(shù)(4.48%)、枸杞子(6.73%)、仙靈脾(4.48%)、川芎(4.48%)、雞血藤(13.45%)、莪術(shù)(4.48%)、腫節(jié)風(fēng)(6.73%)、浙貝母(6.73%)、苦參(5.38%)、水蛭(2.69%)、昆布(8.97%)共15味藥物組成，均購自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院。煎煮方法：將草藥放入鍋內(nèi)，加入10倍體積去離子水，浸泡30分鐘后開始加熱，煮至沸騰，繼續(xù)煎煮30分鐘，將第一煎藥液用80目篩過濾后盛出。鍋中繼續(xù)加入5倍體積去離子水進行第二煎，煮沸后煎煮25分鐘，過濾后與第一煎藥液混合，濃縮成藥物濃度為2.87 g/mL的藥液備用。鹽酸阿霉素(北京索萊寶科技有限公司；貨號:D8740)；RNAsimple總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司；貨號DP419)；FastQuant RT Kit(With gDNase)(天根生化科技有限公司；貨號KR116-02)；2×SYBR Green qPCR Master Mix(Biotool；貨號B21203)；Pierce ECL Western Blotting Substrate(Pierce；貨號32106)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce；貨號：23227)；RECQL4抗體(Sdix；貨號2547.00.02)；β-Actin抗體(北京普利萊基因技術(shù)有限公司；貨號C1313)；山羊抗小鼠/抗兔IgG抗體HRP標(biāo)記(北京普利萊基因技術(shù)有限公司；貨號C1308、C1309)。

熒光定量PCR儀CFX96(美國Bio-Rad)；Mini電泳儀、Mini轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)；Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)FluorChem FC3(美國ProteinSimple)，5804R高速大容量冷凍離心機(德國Eppendorf)。

1.3 4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型制備

取對數(shù)生長期的4T1-luc細胞，配成1×106/mL的細胞懸液，將小鼠用異氟烷氣體麻醉后進行接瘤，每只小鼠乳墊下注射50 uL(5×104個細胞)細胞懸液[10]。

1.4 分組及給藥

按體重將荷瘤小鼠隨機分為對照組、中藥組、阿霉素組和中藥+阿霉素組，每組6只，接種后24小時開始給藥，共28天。參考徐叔云的《藥理實驗方法學(xué)》，人和小鼠的體表面積折算的等效劑量比值為0.0026，故小鼠每日中藥用量為0.580 g，即0.202 mL，為操作方便，灌胃時取0.2 mL/天。阿霉素用蒸餾水配成0.5 mg/mL，4℃避光保存。具體給藥方法：對照組、中藥組分別予0.2 mL蒸餾水和中藥灌胃，1次/日，阿霉素組予阿霉素1.5 mg/kg腹腔注射，1次/日，中藥+阿霉素組予0.2 mL中藥灌胃聯(lián)合阿霉素1.5 mg/kg腹腔注射，1次/日。

1.5 小鼠體重、原位瘤長短徑及瘤重測量

給藥后每隔7天稱量小鼠體重，同時用游標(biāo)卡尺測量小鼠長徑(a)和短徑(b)，在給藥第28天手術(shù)切取小鼠乳腺原位瘤稱重，計算并比較各組小鼠的原位瘤體積和抑瘤率。

腫瘤體積=a×b2/2

抑瘤率=(1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤)×100%

1.6 RealtimePCR檢測原位瘤組織RECQL4 mRNA表達

利用天根RNA提取試劑盒提取總細胞RNA，1 μg RNA合成cDNA。引物序列見表1，以上引物由Invitrogen公司合成。常規(guī)方法，實時定量PCR，獲得CT值。用2-△△CT方法分析各組小鼠目的基因的表達并比較。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 Western-Blot檢測原位瘤組織RECQL4蛋白表達

研磨乳腺原位瘤組織，提取蛋白后BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5% BSA室溫封閉2小時。分別加入稀釋后的一抗β-Actin(抗體按1:1000稀釋)和RECQL4(抗體按1∶10000稀釋)，孵育4℃冰箱過夜，TBST洗膜5 min×3次，分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠/抗兔IgG抗體(抗體按1∶5000稀釋)室溫孵育1小時，用顯影儀曝光。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 固本抑瘤Ⅱ號對小鼠原位瘤瘤重和抑瘤率的影響

與對照組相比，中藥組、阿霉素組和中藥+阿霉素組瘤重均明顯減輕(P<0.01)，抑瘤率分別為25.23%、41.44%、59.46%，且中藥+阿霉素組瘤重低于中藥組和阿霉素組(P<0.01)。見表2。

表2 不同藥物干預(yù)后各組 小鼠原位瘤瘤重及抑瘤率

2.2 固本抑瘤Ⅱ號對荷瘤小鼠體重的影響

體重是觀察藥物療效的一個重要指標(biāo)，在給藥第7天，各組小鼠體重?zé)o明顯差異，在給藥第14天，中藥+阿霉素組小鼠體重較對照組減輕(P<0.05)，在給藥第21天和第28天，阿霉素組和中藥+阿霉素組小鼠體重均明顯低于對照組(P<0.05，P<0.01)，而中藥組小鼠體重與對照組相比未見明顯差異。見表3。

2.3 固本抑瘤Ⅱ號對小鼠原位瘤體積的影響

在給藥前14天，各組原位瘤體積增長均較緩慢，在給藥后14天，各組原位瘤體積增長較前變快，以對照組和中藥組增速較為明顯，中藥+阿霉素組增速最為緩慢。 在給藥第28天， 中藥+阿霉素組小鼠原位瘤體積明顯小于對照組(P<0.01)和中藥組(P<0.05)。見圖1。

表3 不同藥物干預(yù)后各組小鼠體重變化

注：與對照組比較aP<0.01，與中藥組比較bP<0.05。

2.4 固本抑瘤Ⅱ號對RECQL4 mRNA和RECQL4蛋白表達的影響

用Image J軟件計算RECQL4蛋白條帶的灰度值，可以看出，中藥組(P<0.05)、阿霉素組(P<0.01)和中藥+阿霉素組(P<0.01)RECQL4蛋白的表達均較對照組降低，而且與對照組相比，阿霉素組(P<0.05)和中藥+阿霉素組(P<0.01)也抑制了RECQL4 mRNA的表達(見表4、圖2、表5)。

表4 不同藥物干預(yù)后各組小鼠 原位瘤RECQL4 mRNA表達

注：①對照組；②中藥組；③阿霉素組；④中藥+阿霉素組。

表5 不同藥物干預(yù)后各組小鼠原位瘤RECQL4 蛋白表達

3 討論

虛、毒、瘀是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，《素問·刺法論篇》云“正氣存內(nèi)，邪不可干”，《素問·評熱病論篇》云“邪之所湊，其氣必虛”，說明正氣存內(nèi)是機體抗御病邪的防線，正氣不足是邪氣內(nèi)侵的基礎(chǔ)；癌毒是在臟腑功能失調(diào)、氣血郁滯的基礎(chǔ)上，受內(nèi)外多種因素誘導(dǎo)而生成，是導(dǎo)致癌病的一類特異性致病因子[11]，也是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病機；腫瘤屬“癥瘕”“積聚”等范疇，血瘀與其關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤是一個高度血栓前狀態(tài)，可以導(dǎo)致血栓栓塞的風(fēng)險升高4～7倍甚至更高[12]，因此補虛、解毒、化瘀是中藥治療腫瘤的重要法則。郁仁存教授在臨床實踐中提出了腫瘤的“內(nèi)虛學(xué)說”，后續(xù)又發(fā)展出“平衡學(xué)說”和“氣血理論”，在腫瘤治療方面強調(diào)益氣活血解毒法的運用，固本抑瘤Ⅱ號即是郁仁存教授基于此創(chuàng)立。

固本抑瘤Ⅱ號包含15味藥物，方中生黃芪、黨參、茯苓、生白術(shù)等益氣養(yǎng)血，川芎、雞血藤、莪術(shù)等活血化瘀，腫節(jié)風(fēng)、浙貝母、苦參等解毒散結(jié)，扶正與祛邪兼顧，既能提高機體免疫力，又能改善血液高凝狀態(tài)。同時方中的多種藥物均具有抗腫瘤作用，如黃芪中的黃芪多糖可以激活巨噬細胞釋放一氧化氮和腫瘤壞死因子α，進而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[13]；黨參中的多糖CPP1a and CPP1c可以上調(diào)Bax/Bcl-2比值并激活caspase-3，并通過影響腫瘤細胞G2/M時相來抑制腫瘤細胞遷移，促進腫瘤細胞凋亡[14]；茯苓中的茯苓酸可以以濃度和時間依賴性的方式顯著抑制細胞增殖并以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)細胞凋亡，其誘導(dǎo)細胞凋亡部分通過PTEN/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和Caspase 3/7活性介導(dǎo)[15]；雞血藤提取物可以促進腫瘤細胞凋亡和自噬，阻滯細胞周期，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，進而發(fā)揮抗腫瘤作用[16]；莪術(shù)中的有效成分姜黃素、莪術(shù)醇、β-欖香烯等可以通過抑制增殖細胞核抗原Ki-67和PCNA的表達、抑制mTOR信號通路的激活和調(diào)控miRNA的表達來抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[17]；女貞子中的提取物齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷等可以抗誘變，抑制肉瘤、消化系腫瘤、泌尿系腫瘤等多種腫瘤的生長[18]。盡管方中多味中藥在實驗中均表現(xiàn)出抗腫瘤功效，但單味中藥在臨床運用和功效發(fā)揮方面都具有局限性，難以完全覆蓋患者癥狀，因此中藥復(fù)方才是當(dāng)前中醫(yī)治療的主要趨勢。

阿霉素是原發(fā)、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移性乳腺癌的首選化療藥物之一，其屬于細胞毒類藥物，可作用于腫瘤細胞的DNA。盡管阿霉素在乳腺癌化療中廣泛應(yīng)用，但其副作用仍無法避免，主要包括疲乏、心臟毒性、肝功能損傷、脫發(fā)、皮膚色素沉著等[19-20]，因此，如何減輕阿霉素化療中的不良反應(yīng)是臨床醫(yī)生無法逃避的問題，而中藥則是解決方法之一。

筆者團隊的既往研究發(fā)現(xiàn)，在對340例III-IV期腫瘤患者(其中乳腺癌患者105例)的觀察中，固本抑瘤Ⅱ號聯(lián)合化療能提高治療有效率 (CR+PR) (34.9%VS27.6%)，改善化療所致惡心嘔吐、腹瀉及骨髓抑制(P<0.05)，降低治療前纖維蛋白原、纖溶酶和血栓素TXB2水平((P<0.01)，減輕患者高凝狀態(tài)[21]。在基礎(chǔ)研究中，固本抑瘤Ⅱ號以劑量依賴性的方式抑制4T1乳腺癌細胞的增殖，可以降低4T1細胞內(nèi)生長因子(FGF-2和VEGF)的表達，并通過抑制乙酰肝素酶的表達進一步降低絲氨酸-蘇氨酸激酶(AKT)的磷酸化[22]，但在疾病相關(guān)基因?qū)用娴难芯可写钊搿?/p>

通過UALCAN[23](http://ualcan.path.uab.edu)對TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌樣本進行生物信息分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，乳腺癌組織中RECQL4基因表達顯著升高(P<0.01)，進一步對RECQL4基因高表達和低表達患者的生存率進行分析發(fā)現(xiàn)，盡管兩者的生存率沒有顯著差異，但在五年乃至約近10年生存期內(nèi)，RECQL4基因高表達的乳腺癌患者生存率低于RECQL4基因低表達患者，提示RECQL4高表達可能是乳腺癌患者的危險因素。此外，Arora Arvind[24]通過對1900多例乳腺癌樣本中RECQL4的基因拷貝數(shù)、mRNA表達和蛋白質(zhì)水平的大型隊列分析發(fā)現(xiàn)RECQL4高表達與侵襲性腫瘤行為顯著相關(guān)，證實了其對散發(fā)性乳腺癌具有腫瘤促進作用，同時RECQL4基因突變也出現(xiàn)在BRCA1和BRCA2陰性的家族性乳腺癌中[25]，因此，RECQL4可能是乳腺癌治療的一個潛在靶點。

本研究通過體內(nèi)實驗驗證了固本抑瘤Ⅱ號、阿霉素及固本抑瘤Ⅱ號聯(lián)合阿霉素均可對4T1乳腺癌荷瘤小鼠原位瘤產(chǎn)生抑制作用，抑瘤率分別為25.23%、41.44%和59.46%，聯(lián)合應(yīng)用的抑瘤效果更加明顯，其機制可能與抑制RECQL4蛋白的表達有關(guān)。