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    活血解毒中藥配伍抑制心肌細(xì)胞自噬改善大鼠冠脈無(wú)復(fù)流的作用機(jī)制研究

    2021-05-17 12:31:10鄧秘龍霖梓譚令黃明艷曲華付長(zhǎng)庚
    環(huán)球中醫(yī)藥 2021年5期
    關(guān)鍵詞:中藥劑量模型

    鄧秘 龍霖梓 譚令 黃明艷 曲華 付長(zhǎng)庚

    活血解毒中藥配伍由赤芍、川芎、黃連三味中藥組成,該配伍在臨床上廣泛用于改善冠心病的臨床癥狀及預(yù)后[1]。課題組前期通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明活血解毒中藥配伍可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性等途徑改善大鼠心功能[2-4],但對(duì)急性心肌梗死后冠脈無(wú)復(fù)流的研究尚未涉足。故本研究采用缺血再灌注方法制備大鼠冠脈無(wú)復(fù)流模型,觀察活血解毒中藥配伍通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞過(guò)度自噬,減輕無(wú)復(fù)流心肌損傷的作用機(jī)制,以期為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康Wistar大鼠,雄性,SPF級(jí),體質(zhì)量200~220 g(購(gòu)自常州卡文斯,動(dòng)物許可證號(hào)碼:SCXK(蘇)2016-0010),共96只,飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房,白夜交替時(shí)間為12小時(shí),標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由取食及飲水。

    1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

    活血解毒中藥組成為川芎10 g、赤芍10 g、黃連10 g,由江陰天江藥業(yè)有限公司制備成顆粒,然后以生理鹽水配制,高壓滅菌后于-20 ℃條件下貯存;阿司匹林腸溶片(沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司提供,批號(hào):151001,規(guī)格:100 mg/片)。

    1.3 主要試劑及儀器

    氯化硝基四氮唑藍(lán)(國(guó)藥集團(tuán),298-83-9)、硫黃素S(源葉生物,1326-12-1)、透射電子顯微鏡(JEOL,JEM1230)、激光共聚焦顯微鏡(Nikon,C2)、全自動(dòng)生化分析儀(OL YMPUS,AU-400)、PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司,EDC-810)、水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司,JY300)、抗自噬效應(yīng)蛋白Beclin-1抗體(abcam,ab62557)、抗B淋巴細(xì)胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl 2)抗體(abcam,ab196495)、抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)抗體(CST,12741)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

    將96只大鼠隨機(jī)分為6組,包括假手術(shù)組(Sham組)、冠脈無(wú)復(fù)流模型組(I/R組)、活血解毒中藥低劑量組、活血解毒中藥中劑量組、活血解毒中藥高劑量組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組,每組16只。假手術(shù)組及冠脈無(wú)復(fù)流模型組給予等體積生理鹽水灌胃;活血解毒中藥低劑量組[270 mg/(kg·d)]、中劑量組[540 mg/(kg·d)]、高劑量組[1080 mg/(kg·d)]給予等體積活血解毒中藥灌胃;陽(yáng)性藥物對(duì)照組給予阿司匹林30 mg/(kg·d)等體積灌胃,連續(xù)灌胃14天。

    1.5 冠脈無(wú)復(fù)流模型的制備

    采用缺血再灌注方法制備冠脈無(wú)復(fù)流模型[5]。經(jīng)藥物灌胃干預(yù)14天后,按10 mL/kg的劑量腹腔注射3.5%水合氯醛進(jìn)行大鼠麻醉,從左側(cè)第4、5肋間打開(kāi)胸腔,快速取出心臟并于左心耳下2 mm將冠狀動(dòng)脈左前降支鈍性分離,用0號(hào)手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎,然后將心臟放回胸腔,以動(dòng)脈夾夾閉切口,假手術(shù)動(dòng)物只穿線(xiàn)不結(jié)扎。結(jié)扎4小時(shí)后剪斷硅膠管,實(shí)施再灌注8小時(shí),建立大鼠冠脈無(wú)復(fù)流模型。

    1.6 血清CK-MB和cTnT的含量測(cè)定

    每組大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血并分離血清,采用7020型全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase-MB,CK-MB)和肌鈣蛋白 T(cardiac troponin T,cTnT)的含量。

    1.7 心肌梗死面積及無(wú)復(fù)流面積測(cè)定

    再灌注結(jié)束后,每組隨機(jī)選擇8只大鼠并處死,取出心臟稱(chēng)重后均勻地將心室部分切成等厚5片,置于0.2%硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium, N-BT)染液中染色2~3分鐘;用掃描儀掃描心肌獲得掃描圖像,測(cè)量每片心肌雙側(cè)的梗死區(qū)(N-BT非染色區(qū),呈灰白色)和非梗死區(qū)(N-BT染色區(qū),呈藍(lán)黑色)面積,計(jì)算梗死區(qū)面積占全心面積的百分比。將剩下的8只大鼠,自股靜脈注射6% 硫磺素 S(1 mL/kg)后處死,迅速取出心臟,稱(chēng)質(zhì)量后均勻地將心室部分切成等厚5片,分別稱(chēng)質(zhì)量后將心臟切片置于薄層色譜儀的暗箱中,于 365 nm波長(zhǎng)光源下,觀察熒光并用相機(jī)拍照,用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每片心肌雙側(cè)的無(wú)復(fù)流區(qū)(硫磺素不著色,呈暗黑色)和復(fù)流區(qū)(硫磺素著色,呈明亮的藍(lán)綠色),計(jì)算無(wú)復(fù)流區(qū)占全心面積的百分比。

    1.8 Q-PCR檢測(cè)Beclin-1、Bcl 2、LC3 mRNA的表達(dá)

    取大鼠無(wú)復(fù)流心肌組織,用Trizol法提取細(xì)胞總RNA并定量。采用ABI7500 Fast PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增,具體反應(yīng)體系:cDNA模板 1.0 μL、2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 μL、上游引物0.8 μL、下游引物 0.8 μL、50×Rox Dye Ⅱ 0.4 μL、DEPC水7.0 μL,混勻。擴(kuò)增條件為 95℃預(yù)變性30秒,95℃變性3秒,60℃退火15秒,循環(huán)40次。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照,上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分析整理數(shù)據(jù)。引用序列具體見(jiàn)表1。

    1.9 Western blot檢測(cè)Beclin-1、Bcl 2、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達(dá)

    取出大鼠無(wú)復(fù)流心肌組織,加入PMSF單去污劑裂解液進(jìn)行勻漿,4 ℃,12000 rpm離心5分鐘,取上清分裝。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量后,加入上樣蛋白緩沖液100℃沸水浴10分鐘。蛋白變性后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜;用含5%脫脂奶粉的TBS-T(Tris-HCl 20 mM,NaCl 137 mM,0.1% Tween-20)封閉2小時(shí);加入LC3、Beclin-1、Bcl 2一抗(稀釋倍數(shù)1∶1000),在 4℃震蕩過(guò)夜。用TBS-T洗滌后,加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋倍數(shù)1∶2500)孵育、洗滌后,加入ECL 發(fā)光液,用凝膠成像系統(tǒng)掃描并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 活血解毒中藥配伍對(duì)大鼠血清學(xué)心肌損傷標(biāo)志物的影響

    與假手術(shù)組比較,冠脈無(wú)復(fù)流模型組大鼠血清CK-MB及cTnT顯著升高(P<0.01),提示模型制備成功;相較于冠脈無(wú)復(fù)流模型組,活血解毒中藥低、中、高劑量組大鼠經(jīng)過(guò)缺血再灌注后血清CK-MB和cTnT均降低(P<0.01),且以中劑量組效果最佳,表明活血解毒中藥能減輕無(wú)復(fù)流導(dǎo)致的心肌損傷。見(jiàn)表2。

    2.2 活血解毒中藥配伍對(duì)大鼠心肌梗死面積及無(wú)復(fù)流區(qū)域面積的影響

    相較于假手術(shù)組,冠脈無(wú)復(fù)流模型組及藥物處理組大鼠心肌梗死面積及無(wú)復(fù)流區(qū)域面積均顯著增加(P<0.01);與冠脈無(wú)復(fù)流模型組大鼠相比較,活血解毒中藥不同劑量組大鼠心肌梗死面積和無(wú)復(fù)流區(qū)域面積均顯著減少(P<0.01),且中藥中高劑量組較低劑量組更為顯著(P<0.01),表明活血解毒中藥能有效減少大鼠缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的心肌梗死面積和冠脈無(wú)復(fù)流區(qū)域面積。見(jiàn)表3。

    表1 引物序列如下表所示

    表2 各組大鼠血清CK-MB、cTnT水平比較

    表3 各組大鼠心肌梗死面積及心肌 無(wú)復(fù)流區(qū)面積比較

    2.3 活血解毒中藥對(duì)缺血再灌注大鼠心肌自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

    與冠脈無(wú)復(fù)流模型組大鼠相比較,活血解毒中藥不同劑量組大鼠經(jīng)過(guò)缺血再灌注后心肌自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3II/I表達(dá)降低,Bcl 2表達(dá)增加(P<0.01),并且以中高劑量組抑制心肌細(xì)胞自噬效果最佳,表明活血解毒中藥能夠調(diào)控心肌細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá),對(duì)無(wú)復(fù)流區(qū)域心肌細(xì)胞的過(guò)度自噬起抑制作用。見(jiàn)表4。

    表4 各組大鼠心肌無(wú)復(fù)流區(qū)域Beclin-1、 LC3II/I及Bcl 2基因表達(dá)的比較

    2.4 活血解毒中藥對(duì)缺血再灌注大鼠心肌自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    與冠脈無(wú)復(fù)流模型組大鼠相比較,活血解毒中藥低、中、高劑量組大鼠自噬正相關(guān)蛋白Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)降低(P<0.01),自噬負(fù)相關(guān)蛋白Bcl 2表達(dá)顯著升高(P<0.01),表明活血解毒中藥可抑制大鼠無(wú)復(fù)流區(qū)域心肌細(xì)胞的過(guò)度自噬。見(jiàn)圖1。

    注:①假手術(shù)組;②冠脈無(wú)復(fù)流模型組;③中藥低劑量組;④中藥中劑量組;⑤中藥高劑量組;⑥阿司匹林組。

    3 討論

    冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流(coronary artery no-reflow, CNR)是指經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention, PCI)治療后,相關(guān)罪犯血管實(shí)現(xiàn)再通,但心肌組織仍存在無(wú)灌注或灌注不良的現(xiàn)象[6]。無(wú)復(fù)流現(xiàn)象在擇期PCI術(shù)后的發(fā)生率約為 1%~5%,急診PCI中的發(fā)生率可高達(dá)25%~40%[7]。Nair等[8-9]研究發(fā)現(xiàn),相較于PCI術(shù)后血流正常組,無(wú)復(fù)流患者嚴(yán)重心律失常、心力衰竭和住院死亡率的發(fā)生率均顯著升高,嚴(yán)重降低了患者的臨床獲益。因此,如何有效預(yù)防冠脈無(wú)復(fù)流的發(fā)生是當(dāng)前臨床面臨的難題。新近研究表明冠脈無(wú)復(fù)流現(xiàn)象與心肌細(xì)胞的自噬與凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、心臟微循環(huán)障礙等因素相關(guān)[10-11]。Mehrdad等[12-13]發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死實(shí)現(xiàn)血管再通后會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞過(guò)度自噬,從而加重心肌損傷,而抑制心肌自噬活性則會(huì)減輕缺血再灌注損傷,達(dá)到保護(hù)心肌組織的目的[14-15]。因此,通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞自噬防治冠脈無(wú)復(fù)流可能是減輕冠心病介入治療圍手術(shù)期心肌損傷的治療方法之一[16-17]。

    自噬相關(guān)基因(Atg)調(diào)控自噬,其中Atg8(LC3)和Atg6(beclin-1)是調(diào)控自噬的重要基因。Beclin-1能與Vps34結(jié)合參與自噬體的形成和成熟,是正向調(diào)控自噬的重要因子。LC3有LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩個(gè)亞型,當(dāng)自噬激活時(shí),水溶性L(fǎng)C3Ⅰ轉(zhuǎn)化為自噬囊泡相關(guān)型LC3Ⅱ,參與后期自噬體的合成[18-19]。因此,測(cè)定LC3Ⅱ/Ⅰ的比值能代表自噬的變化,當(dāng)LC3Ⅱ/Ⅰ升高時(shí)表示自噬活性增強(qiáng),反之則表示自噬受到抑制。此外,由于自噬和凋亡之間存在相同的信號(hào)通路,凋亡相關(guān)蛋白Bcl 2通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)Beclin-1,從而抑制自噬活性[20]。在本研究中,課題組發(fā)現(xiàn)相較于冠脈無(wú)復(fù)流模型組,經(jīng)活血解毒中藥預(yù)處理后自噬正相關(guān)基因Beclin-1、LC3Ⅱ表達(dá)降低,自噬負(fù)調(diào)節(jié)基因Bcl 2表達(dá)升高,與崔建坤等[21]通過(guò)制備大鼠心肌缺血再灌注模型,探討去甲氧姜黃素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用結(jié)果一致。

    冠狀動(dòng)脈無(wú)復(fù)流導(dǎo)致的心肌損傷,根據(jù)其病機(jī)特點(diǎn)應(yīng)歸屬于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”的范疇。本研究中活血解毒中藥配伍源于國(guó)家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心治療冠心病的經(jīng)驗(yàn)效方——愈梗通瘀湯。赤芍、川芎、黃連三味中藥配伍高度契合冠心病“毒瘀搏結(jié)、痹阻心脈”的病機(jī)。黃連最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》中,有清熱燥濕、瀉火解毒的作用?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究提示,黃連素能通過(guò)抑制血栓素、前列環(huán)素的合成等途徑抗血小板聚集[22]。川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪、藁本內(nèi)酯等有效成分,具有抗血栓形成及抗血小板聚集的作用[23]。赤芍有清熱涼血、散瘀止痛的功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)赤芍總苷具有抗凝血及抗血栓作用[24]。因此,上述三味活血解毒中藥配伍可通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)改善缺血性心肌損傷,達(dá)到保護(hù)心功能的目的。

    綜上,課題組認(rèn)為活血解毒中藥配伍能降低冠脈無(wú)復(fù)流損傷大鼠血清 CK-MB、cTnT水平,減少心肌無(wú)復(fù)流面積,其機(jī)制與抑制大鼠心肌細(xì)胞過(guò)度自噬相關(guān)。

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