益氣活血方對大鼠心肌梗死后心肌肥大的影響及作用機(jī)制

魏路路 郭書文 馮鵬飛 王惠 黃琦惠 劉云柯 魏梵域

心肌梗死是由于持續(xù)性缺血和缺氧而引起的心肌壞死疾病[1]，是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)心血管疾病高死亡率的主要因素[2]。心肌肥大作為心肌梗死后的適應(yīng)性反應(yīng)[3]，是誘發(fā)心力衰竭的主要風(fēng)險因素[4]，因此防治心肌肥大是治療心肌梗死的重要方向。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是促分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的重要組成部分，可促進(jìn)心臟生長[5]，參與心肌肥大的發(fā)生與發(fā)展[6]。課題組常用研究組方益氣活血方在前期研究中顯示能夠抑制大鼠心肌梗死后的心室重構(gòu)，本研究重點觀察益氣活血方對心肌梗死大鼠心肌肥大相關(guān)指標(biāo)的影響，并探究其是否與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠50只，體重200～220 g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，飲食由動物房提供。

1.2 藥物的制備

益氣活血方由生黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、人參10 g、三七6 g、川芎15 g組成，購買于北京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診部(該藥已申請專利，申請?zhí)枮?01610368030.7)。由中日醫(yī)院藥劑科制備，按照口服劑制作工藝，按處方稱取中藥材，加9倍量水，煎煮2次，每次2.5小時，共5小時，水煎液過濾、濃縮，調(diào)整濃度為1∶2(每毫升溶液對應(yīng)生藥0.82 g)，分裝于100 mL玻璃瓶，滅菌備用。

對照藥酒石酸美托洛爾片，阿斯利康制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H32025391，生產(chǎn)批號：1805A23，規(guī)格：25 mg×20片。

1.3 模型的建立

采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支(left anterior descending，LAD)的方法制作急性心肌梗死動物模型。動物麻醉選用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射，麻倒后仰臥位固定于鼠板，剃毛備皮，行氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)。定位左側(cè)第三、四肋間橫向剪開皮膚及肌肉，撕開心包膜，充分暴露心臟，以冠脈主干為標(biāo)志，在左心耳下2 mm處用5/0無菌帶線縫合針結(jié)扎LAD。以結(jié)扎部位及以下區(qū)域變白為結(jié)扎成功的標(biāo)志。將心臟復(fù)原，關(guān)胸縫合，脫離呼吸機(jī)，盡快恢復(fù)自主呼吸。假手術(shù)組僅將手術(shù)線穿過LAD，不結(jié)扎，其余步驟同模型組相同，手術(shù)過程嚴(yán)格無菌操作。以術(shù)后30分鐘心電圖ST段抬高并且24小時心電圖出現(xiàn)5個以上病理性Q波為造模成功的標(biāo)志。

1.4 分組及給藥

用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的大鼠隨機(jī)分配，分為模型組、益氣活血藥組、酒石酸美托洛爾組，另設(shè)假手術(shù)組，每組9只。干預(yù)治療7天后進(jìn)行相關(guān)檢查。術(shù)后第2天給予相應(yīng)藥物灌胃，益氣活血藥組[8.2 mg/(kg·d)]，酒石酸美托洛爾組[5 mg/(kg·d)]，模型組和假手術(shù)組給予等量蒸餾水，每日1次。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 超聲檢測左心功能指標(biāo) 采用影像Vevo770高分辨小動物超聲系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司)檢測左心功能指標(biāo)，通過高頻探頭RMV716取左室短軸切面，獲得M型曲線并進(jìn)行分析，連續(xù)取3個心動周期，計算平均值。主要參數(shù)為：左室射血分?jǐn)?shù)(left venteicular ejection fraction，LVEF)、左室短軸率(left ventricular shortening fraction，LVFS)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)和左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)。

1.5.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 將心肌組織用4%多聚甲醛固定，24小時后取出固定材料進(jìn)行常規(guī)包埋切片(4 μm)，行HE染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，中性樹脂封片，切片于全景掃描儀中觀察并采集圖像。用Image-Pro Plus軟件完成橫截面積、直徑和周長的測量。

1.5.3 免疫組化法檢測梗死邊緣區(qū)心房鈉尿肽的表達(dá) 石蠟切片脫蠟至水，將組織切片置于盛滿乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原修復(fù)緩沖液(pH 8.0)的修復(fù)盒中于蒸鍋內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后放于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌，之后放入3%過氧化氫溶液，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，畫圈，血清封閉，加入配置好的一抗，4°C孵育過夜，加入二抗，孵育辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，去除PBS溶液，加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)溶液顯色，蘇木素復(fù)染核，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，于全景掃描儀中觀察并采集圖像。

1.5.4 免疫印跡法(western blot，WB)檢測梗死邊緣區(qū)蛋白表達(dá)情況 通過WB檢測各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌肥大相關(guān)指標(biāo)心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、β肌球蛋白重鏈(β-mysion heavy chain，β-MHC)的蛋白表達(dá)情況。為進(jìn)一步探究益氣活血方治療心肌肥大與ERK通路的關(guān)系，故僅予觀察益氣活血組、模型組與假手術(shù)組ERK1/2、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(phosphorylation extracellular signal-regulated kinase，p-ERK1/2)的蛋白表達(dá)情況。按照試劑盒的說明進(jìn)行樣本蛋白的提取以及調(diào)配相應(yīng)濃度凝膠，取50 μg樣本蛋白在SDS-PAGE凝膠上電泳，濃縮膠恒壓80 V約20分鐘，分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(轉(zhuǎn)模時間2小時)，轉(zhuǎn)移結(jié)束后將PVDF膜浸泡于WB封閉液中搖床輕搖1小時，加入經(jīng)1%BSA/5%milk稀釋好的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加入對應(yīng)的二抗室溫輕搖50分鐘，再次TBST洗膜，最后將PVDF膜浸泡于ECL顯色液中1分鐘，暗室中曝光，顯影并定影，條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進(jìn)行讀取，各組分別與內(nèi)參β-action比較得到相對光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 益氣活血方對各組大鼠小動物超聲結(jié)果

模型組大鼠相較假手術(shù)組LVFS、LVEF均顯著降低(P<0.01)，LVIDs、LVIDd均顯著升高(P<0.01)。兩用藥組相較模型組LVFS、LVEF均顯著升高(P<0.01，P<0.05)，LVIDs、LVIDd均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2 益氣活血方對各組大鼠HE染色及橫截面積、直徑、周長的結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊， 胞核位于細(xì)胞中央， 未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組細(xì)胞形狀不規(guī)則，排列紊亂，胞核游離，細(xì)胞間隙變大，伴隨炎性細(xì)胞浸潤。兩用藥組相較模型組，排列相對整齊，細(xì)胞間隙變小，胞核游離情況減輕，見圖1。

表1 益氣活血方對各組大鼠小動物超聲結(jié)果

梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞的橫截面積、直徑和周長結(jié)果如表2所示。與假手術(shù)組相比，模型組心肌細(xì)胞橫截面積、直徑和周長均顯著增高(P<0.01)；與模型組相比，兩用藥組三者均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞HE染色比較(×400)

表2 益氣活血方對各組大鼠心肌細(xì)胞橫截面積、 直徑和周長的結(jié)果比較

2.3 益氣活血方對各組大鼠免疫組化檢測梗死邊緣區(qū)ANP的表達(dá)結(jié)果

假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊且清晰，模型組ANP陽性表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，可見大片棕褐色顆粒聚集成片，少量細(xì)胞核淡藍(lán)色表達(dá)。兩用藥組相較模型組呈少量ANP表達(dá)陽性，表達(dá)部位呈淺染或深染的棕色顆粒，見圖2。

圖2 各組大鼠ANP蛋白的表達(dá)結(jié)果(標(biāo)尺=50 μm)

2.4 益氣活血方對各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌肥大指標(biāo)ANP、β-MHC蛋白的表達(dá)

檢查各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌肥大指標(biāo)ANP、β-MHC蛋白的表達(dá)情況顯示：與假手術(shù)組相比，模型組的ANP、β-MHC蛋白均顯著提高(P<0.01)；與模型組相比，兩用藥組的ANP、β-MHC蛋白均顯著下降(P<0.01)，見表3、圖3。

表3 益氣活血方對各組大鼠ANP、β-MHC蛋白 表達(dá)比較

注：J為假手術(shù)組；M為模型組；Y為益氣活血組；MT為美托洛爾組

2.5 益氣活血方對各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)

檢查心肌細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)情況顯示：與假手術(shù)組相比，模型組的p-ERK1/2蛋白顯著升高(P<0.01)，ERK1/2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，益氣活血組的p-ERK1/2蛋白顯著降低(P<0.01)，ERK1/2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖4。

表4 益氣活血方對各組大鼠梗死邊緣區(qū)ERK1/2、 p-ERK1/2蛋白的表達(dá)比較

注：J為假手術(shù)組；M為模型組；Y為益氣活血組

3 討論

心肌梗死發(fā)生后，為了補償功能性心肌細(xì)胞的損失，心臟會發(fā)生一系列的結(jié)構(gòu)改變來完成重構(gòu)[7]。心室重構(gòu)的潛在機(jī)制是多因素的，如氧化應(yīng)激、炎癥、肥大和纖維化[8]。肥大和纖維化是進(jìn)行性心臟病的早期指征，增加了心力衰竭、復(fù)發(fā)性心梗、心律不齊和猝死的風(fēng)險[9]。益氣活血方是治療胸痹的經(jīng)驗方，臨床上取得了良好的療效。課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)[10-11]，益氣活血方能夠很好的延緩纖維化，增強(qiáng)抗氧化能力，抑制細(xì)胞凋亡和壞死，從而防治心肌梗死后的心室重構(gòu)。本研究重點觀察益氣活血方對心肌梗死后心肌肥大的影響，并探究其可能的作用機(jī)制，為了更直觀的對比該方的療效，選用酒石酸美托洛爾作為對照藥。

本研究通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制作了心肌梗死大鼠模型，并進(jìn)行了超聲和HE染色以及心肌肥大特應(yīng)性指標(biāo)如心肌細(xì)胞橫截面積、直徑、周長的測量，模型組與假手術(shù)組相比，LVIDs、LVIDd、橫截面積、直徑、周長都顯著增高，EF、FS顯著降低，反映出心梗模型的建立是成功的，并且發(fā)生了心肌肥大的適應(yīng)性改變。益氣活血藥組與模型組的對比證明益氣活血方能夠改善心肌梗死后的心肌肥大狀況，減輕心室重構(gòu)。

ANP是心臟分泌的一種肽激素，屬于利鈉肽家族的一員[12]。ANP的主要功能為利鈉、利水和舒張血管，能夠維持水鹽平衡。當(dāng)心肌細(xì)胞承受更高的血流壓力時，它會上調(diào)血管緊張素的表達(dá)，從而釋放出更多的ANP，導(dǎo)致心肌肥大的發(fā)生[13]，因而ANP常被看做心肌肥大的標(biāo)志基因。β-MHC是肌球蛋白的基本成分，可為肌肉收縮提供動力。心肌肥大時常常伴隨著β-MHC的上調(diào)[14]。β-MHC表達(dá)的上升與ANP的過表達(dá)常被看做心肌肥大的標(biāo)志。本研究中模型組的ANP和β-MHC的表達(dá)相較假手術(shù)組均顯著升高，這與CHEN等[15]的研究是一致的。益氣活血藥組與模型組相比，益氣活血方能夠降低心肌肥大的程度，抑制ANP和β-MHC蛋白的表達(dá)。

心肌肥大是心臟在受到有害刺激時為了維持心輸出量而進(jìn)行的適應(yīng)性和代償性改變[16]。主要分生理性肥大和病理性肥大兩種，前者是心臟在面對外來刺激時做出的順應(yīng)性改變，對機(jī)體是無害的，后者是面臨病理刺激時發(fā)生的不可逆的適應(yīng)不良性肥大。ERK信號通路是最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物反應(yīng)[17]，ERK通路的激活參與生理性和病理性肥大[18]。本研究通過對ERK1/2與p-ERK1/2蛋白表達(dá)的檢測，發(fā)現(xiàn)模型組中磷酸化ERK1/2蛋白較假手術(shù)組顯著增高，說明ERK1/2信號通路在模型組被激活，而益氣活血藥組可顯著降低磷酸化的ERK1/2蛋白，因此我們推測益氣活血方改善心肌梗死后的心室肥大可能與抑制ERK1/2信號通路有關(guān)。