基于有效基準特征圖譜質量表征的江香薷飲片質量評價研究

李文霞 孔靜 武秋紅 王夢林 路東波 孫仁弟 黃廣偉 李思潼 范圓圓 黃玉娟 高園園 劉路路 陳思玉 姜艷艷 石任兵

香薷為唇形科植物石香薷MoslachinensisMaxim.或江香薷ModachinensisMaxim.cv.jiangxiangru的干燥地上部分，前者習稱“青香薷”，后者習稱“江香薷”。本文主要基于江香薷進行質量評價研究，其性辛，微溫，藥食兼用，屬于藥食同源物品，具有發(fā)汗解暑、行水散濕、溫胃調中的功效，臨床多用于抗菌、抗病毒、調血脂、降低膽固醇、抗氧化、增強免疫等；其主要成分含有酚酸類、黃酮類、萜類，此外還含有苯丙素類、脂肪酸等[1-7]。2015版、2020版《中國藥典》一部以江香薷中揮發(fā)油成分對其進行質量標準控制；文獻報道主要對其揮發(fā)油中單萜類成分(香荊芥酚、麝香草酚)與黃酮類成分進行含量測定[8-11]。

為了能整體、有效、精準地表征與評價中藥質量，本課題組基于自然藥學觀藥物體系理念，相繼建立了中藥質量表征模式、方法與應用[12-28]。筆者在基于活血藥效對江香薷飲片進行藥物體系研究時發(fā)現(xiàn)，其活血藥效的藥學架構主要為其酚酸類、黃酮類及萜類成分。本文研究中以確定有活血藥效的江香薷飲片作為飲片基準(S5)，以飲片基準中黃酮類有效特征指標性成分黃芩素-7-甲醚作為質量表征基準點，采用HPLC-PDA建立江香薷有效基準特征圖譜，其 15個共有特征峰及其7個特征代表性成分涵蓋了酚酸類、黃酮類及萜類三種主要化學類型；以黃芩素-7-甲醚對照品模擬基準點的有效基準特征圖譜質量表征信息，作為江香薷飲片的質量基準標尺，并對其準確性進行佐證及質量評價應用與驗證。所建立的有效基準特征圖譜質量表征模式、方法，可整體、有效、精準、簡易地對江香薷飲片進行質量評價與篩選。

1 材料

1.1 主要的儀器

Waters e2695 自動進樣高效液相色譜儀，2998PDA 檢測器，Empower 工作站，Sartorius BT 25S 型 1 /100 000 電子分析天平( 北京賽多利斯儀器有限公司) ，AL204 型1 /10 000 電子分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)，KQ-500 DE 型數控超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司)，RE-52 A型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；ZNHW型智能恒溫電熱套(鄭州恒巖儀器有限公司)。

1.2 主要的試藥與試劑

咖啡酸(批號：Y09J8C28349，純度≥98 %)、異迷迭香酸苷(批號：R02M9F60399，純度≥98 %)、野黃芩苷(批號：Z17O7XX22900，純度≥98 %)、迷迭香酸(批號：S03N8H47130，純度≥98 %)、黃芩素-7-甲醚(批號：P15J8F38064，純度≥98 %)、 香荊芥酚(批號：Z13M8H35994，純度≥98 %)、麝香草酚(批號：TN1112CB14，純度≥98 %)對照品均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司)；分析甲醇(購自北京化工廠)；磷酸(北京化學試劑公司)；娃哈哈水( 杭州娃哈哈集團有限公司)。

14批江香薷飲片分別購自北京市各藥店，見表1，并經北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定所購江香薷飲片均為正品，飲片標本現(xiàn)存于北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥化學系。

2 方法和結果

2.1 有效基準特征圖譜質量表征方法的建立

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取咖啡酸、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚各對照品4.56 mg、2.04 mg、11.04 mg、4.06 mg、9.48 mg、7.80 mg，分別置6個10 mL的量瓶中；精密稱取異迷迭香酸苷4.38 mg置100 mL量瓶中，分別用70 % 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，然后再依次精密量取上述各對照品溶液0.0220 mL、0.9800 mL、0.2430 mL、0.1133 mL、0.1300 mL、0.2300 mL置同一5 mL量瓶中，精密量取異迷迭香酸苷對照品溶液3.62 mL置另一5 mL量瓶中，分別用70 % 甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚濃度分別為2.01 μg/mL、31.71 μg/mL、39.98 μg/mL、53.65 μg/mL、9.20 μg/mL、24.65 μg/mL、46.94 μg/mL的混合對照品溶液。

表1 14批江香薷飲片信息

2.1.2 供試品溶液的制備 取過2號篩的飲片基準(飲片編號S5)粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞的錐形瓶中，精密加入90 % 甲醇50 mL ，稱定其重量，加熱回流提取1 小時，冷卻至室溫，再稱定其重量，用90 % 甲醇補足失重，搖勻，濾過，用 0.45 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜檢測條件 通過自建的色譜檢測條件：Waters XBridge Shield RP18色譜柱( 4.6 mm×250 mm，5 μm) ，流動相為乙腈-0.2 % 磷酸水，梯度洗脫，梯度洗脫條件見表2，流速 0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長270 nm，進樣量20 μL；在此色譜條件下，江香薷混合對照品及供試品溶液的HPLC 圖譜見圖1。

表2 HPLC 梯度洗脫條件

如圖所示，15個特征峰分離度良好，通過與咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚各對照品紫外吸收光譜對比，判斷15個特征峰對應的化學成分類型，涵蓋了酚酸類、黃酮類、萜類3種主要化學成分類型。

2.1.4有效基準特征圖譜方法學考察 (1)精密度考察：精密吸取同一供試品溶液20 μL，按2.1.3項下色譜檢測條件，連續(xù)進樣6次檢測，以黃芩素-7-甲醚為參照，計算各色譜峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示：各特征峰相對保留時間的RSD 均<1.49 % ，各特征峰相對峰面積的RSD均<2.78 % ，表明儀器精密度良好，符合特征圖譜要求(≤3%)[27]。(2)穩(wěn)定性考察: 精密吸取同一供試品溶液20 μL，按2.1.3項下色譜檢測條件，于0小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24 小時分別進樣檢測，以黃芩素-7-甲醚為參照，計算各色譜峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示：各特征峰相對保留時間的RSD均<2.34 % ，各特征峰相對峰面積的 RSD均<2.60 %，說明樣品溶液在24小時內穩(wěn)定(≤3%)[27]。(3)重復性考察：取同一批(S5)江香薷飲片，按2.1.2項下方法平行制備 6 份供試品溶液，按2.1.3項下色譜檢測條件分別進樣檢測，計算各色譜峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示：各特征峰相對保留時間的RSD均<2.25 % ，各特征峰相對峰面積的RSD均<2.04 %，說明本方法重復性良好(≤3%)[27]。

A:供試品 ( 270 nm) ; B: 混合對照品 ( 270 nm)

2.1.5 特征代表性成分含量測定方法學考察 (1)線性關系考察：按2.1.3項下色譜檢測條件，精密吸取混合對照品溶液，分別設置進樣量5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL、35 μL、40 μL進樣檢測，以進樣量(μg) 為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數，結果見表 3。

表3 7個特征代表性成分的線性關系考察結果 (n=8)

(2)精密度考察：精密吸取同一供試品溶液20 μL，按2.1.3項下色譜檢測條件，連續(xù)進樣6次，計算咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚峰面積的RSD分別為 2.70%、 2.37%、0.35%、1.19%、1.29%、1.41%、2.21%，表明儀器精密度良好，符合含量測定要求(<5%)[27]。(3)穩(wěn)定性考察：精密吸取同一供試品溶液20 μL，按2.1.3項下色譜檢測條件，于0小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時分別進樣檢測，計算咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚峰面積的RSD分別為1.15%、2.80%、1.67%、2.23%、1.87%、1.97%、1.25%，表明供試品溶液在24小時內穩(wěn)定性良好。(4)重復性考察：取同一批(S5)江香薷飲片，按2.1.2項下方法平行制備 6 份供試品溶液，按2.1.3項下色譜檢測條件分別進樣檢測，結果顯示：咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚的平均含量分別為 0.02%、0.33%、0.40%、0.62%、0.11%、 0.20%、 0.37%，RSD值分別為2.04%、1.62%、1.20%、0.73%、0.59%、0.99%、1.14%，表明本方法重復性良好。(5)加樣回收率考察：取已知特征指標性成分含量的過二號篩的江香薷飲片(S5)約 0.25 g，精密稱定 6 份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.3項下色譜檢測條件分別進樣測定，計算得咖啡酸、異迷迭香酸苷、野黃芩苷、迷迭香酸、黃芩素-7-甲醚、香荊芥酚、麝香草酚平均加樣回收率分別為98.92%、101.59%、102.31%、99.82%、99.97%、100.75%、99.90%，RSD分別為2.28%、2.47%、2.19%、1.64%、1.65%、2.24%、2.85%，符合定量要求，說明本方法準確可靠，結果見表4。

2.1.6 模擬基準點質量表征考察 文獻報道黃酮類成分具有擴張血管、促進血液循環(huán)的作用[1,28]，因此以黃酮類有效特征代表性成分黃芩素-7-甲醚作為質量表征基準點。精密稱取黃芩素-7-甲醚對照品2.30 mg于20 mL容量瓶中，用90% 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密移取1 mL至10 mL容量瓶中，用90% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.0115 mg/mL的黃芩素-7-甲醚對照品溶液作為模擬基準點，即與2.1.2項下制備江香薷飲片(S5)供試品溶液中所檢測的黃芩素-7-甲醚含量相同，按2.1.3項下色譜檢測條件，得模擬基準點的HPLC色譜圖，見圖2。

由模擬基準點色譜圖可得其保留時間：61.020分鐘，峰面積：937319 ，與江香薷有效基準特征圖譜中黃芩素-7-甲醚的保留時間(61.012 分鐘)、峰面積(891286 )基本吻合，表明所建立的檢測方法及其檢測結果與模擬江香薷質量表征基準點均具有準確性，即0.0115 mg/mL黃芩素-7-甲醚對照品溶液可作為模擬基準點。

2.2 有效基準特征圖譜質量表征信息

以確定有活血藥效的江香薷飲片(S5)作為有效飲片(基準)，在其有效基準特征圖譜中，共指認出了 15 個特征峰，其中酚酸類特征峰 10 個，黃酮類特征峰 3 個，揮發(fā)油中萜類特征峰2個；有效基準特征圖譜中15個特征峰的保留時間、峰面積(均以100 mg飲片量計)、含量，以模擬基準點為基準得到的相對保留時間、相對峰面積、相對含量、換算系數(特征代表性成分的相對含量/特征代表性成分的相對峰面積)，見表5。

表4 加樣回收率考察結果 (n=2)

圖2 模擬基準點的 HPLC 色譜圖(270nm)

表5 江香薷有效基準特征圖譜質量表征信息

由表5可得，以對照品模擬基準點為基準得到的15個特征峰的相對保留時間、相對峰面積及7個特征指標性成分的相對含量、含量換算系數，即為江香薷有效質量基準標尺。

2.3 應用與驗證

取 13 批待評價江香薷飲片，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.3項下色譜檢測條件進樣檢測，得到 13 批待評價江香薷飲片質量表征信息，同時實測江香薷飲片S5(基準)有效基準特征圖譜，以及實測13批待評價江香薷飲片特征指標性成分含量，以驗證基于質量標尺進行江香薷質量評價的準確性，如圖3、4、5、6及表6所示。

如圖3、4所示，13批江香薷飲片特征圖譜皆含有與有效飲片(S5)基準15個相同的特征峰，且15個特征峰相對保留時間與基準標尺基本一致，同時也與實測值相吻合，表明13批飲片皆為江香薷飲片，且驗證了應用基準標尺辨別江香薷飲片真?zhèn)蔚臏蚀_性。結果表明：江香薷質量評價標尺中質的標尺具有可行性，可依據其判斷江香薷飲片的真?zhèn)渭皩戕柑卣鲌D譜中各特征峰進行指認。

由圖5、6可見13批江香薷飲片質量表征信息，可依據其特征峰相對峰面積及相對含量高于其基準標尺對應點的數目、幅度和所涵蓋的3種主要化學類型及其黃芩素-7-甲醚同類成分，可對江香薷飲片的質量優(yōu)劣進行評價；在所研究的14批江香薷飲片中，綜合考量評價得出編號S13飲片質量較優(yōu)，其次是編號S3、S8、S2、S1、S10、S12飲片。

由表6可見，換算含量與實測含量基本一致，即驗證了代表性成分換算含量結果的準確性及其相對含量結果的準確性。結果表明：江香薷質量評價標尺中量的標尺具有可行性，可依據其判斷江香薷飲片的質量優(yōu)劣。

注：1-4、6-9: 酚酸類; 5: 咖啡酸; 9: 異迷迭香酸苷; 10: 野黃芩苷;11: 黃酮類 12: 迷迭香酸; 13: 黃芩素-7-甲醚; 14: 香荊芥酚;15: 麝香草酚

圖4 13批江香薷飲片與基準(S5)相對保留時間

圖5 13批江香薷飲片與基準(S5)相對峰面積

圖6 13批江香薷飲片與基準(S5)相對含量

表6 14批江香薷飲片中7個特征指標性成分含量考察結果 (%，n=2)

3 討論

本文報道研究建立的江香薷有效基準特征圖譜質量表征模式、方法，所關注的江香薷飲片中15個特征峰涵蓋了其藥學架構組成的酚酸類、黃酮類、萜類三種主要化學類型，其中酚酸類成分中咖啡酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸及黃酮類成分中野黃芩苷具有抗血小板聚集、抗血栓作用[29-31]，黃芩素-7-甲醚及2個揮發(fā)油中萜類成分香荊芥酚、麝香草酚有擴張血管、降低血液稠度、促進血液循環(huán)等作用[1,28,32]，從而整體的反映了江香薷飲片發(fā)揮活血藥效的有效物質基礎；基于此，對14批江香薷飲片進行了質量優(yōu)良度評價，得出編號S13飲片質量較優(yōu)，其次是編號S3、S8、S2、S1、S10、S12飲片。建立的江香薷有效基準特征圖譜質量表征模式、方法，可簡易、準確、整體地對江香薷飲片進行質量表征，并可應用于精準、有效的評價江香薷飲片質量，構建的江香薷質量評價模式關注了飲片質量的精確性與應用有效性，從而為江香薷飲片的精準質量評價與篩選提供了科學依據，亦為其他中藥質量表征與評價提供借鑒。

本研究收集了除江香薷飲片S5(飲片基準)外的13批江香薷飲片，結果發(fā)現(xiàn)來自不同產地的飲片質量差異性不顯著，由于實驗采集樣品數量只有14批，且只收集了三個產地的江香薷飲片，不能得出有效的統(tǒng)計結論。但在江香薷飲片質量不一的現(xiàn)狀下，可關注多種特征成分的類型、含量、峰面積及江香薷有效質量基準標尺，以全面客觀評價江香薷飲片的質量，從而完善其質量標準。