基于有效基準特征圖譜質量表征的甜葉菊飲片質量評價研究

高園園 范圓圓 劉路路 陳思玉 李思潼 潘鋒 李林福 舒一崧 孫仁弟 黃廣偉 姜艷艷 石任兵

甜葉菊SteviarebaudianaBertoni別名甜菊、糖草，為菊科Composite斯臺比亞屬Stevia多年生草本植物，原產(chǎn)于南美巴拉圭和巴西交界的高山草地，1977年在中國引進栽培成功[1]。文獻表明，甜葉菊中含有ent-貝殼杉烯型二萜類、半日花烷型二萜及半日花烷型雙降二萜類、黃酮類、揮發(fā)油類及其他三萜及甾體類，常用來作為甜味劑、藥品輔料、矯味劑，用于食品保鮮與藥品防霉，用來治療高血壓、糖尿病、肥胖及胃酸多伴有潰瘍，用來預防齲齒等[2]。有文獻對甜葉菊中萜類成分甜菊糖苷、萊鮑迪苷A等成分進行含量測定[3-4]，對酚酸類成分綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等成分進行含量測定[5-6]，但尚未見有關特征圖譜對甜葉菊飲片進行質量表征與質量評價的研究報道。

本文研究基于本課題組對甜葉菊降糖降脂藥物體系及其有效部位制備工藝、質量表征研究積淀，發(fā)現(xiàn)苯乙醇苷類組分及其新成分TYJ-10：2-(4-羥基苯基)乙基-β-D-巢菜糖苷[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-β-vicianoside]，并揭示了其藥學架構主要化學類型，即在自然藥學觀理論指導下[7-10]，發(fā)現(xiàn)了甜葉菊酚類有效部位(甜菊酚)的苯乙醇苷類，酚酸類和黃酮類成分為其主要的降血糖類藥組分，闡明了甜葉菊降糖降脂有效部位及作用機制[11-14]。并基于本課題組創(chuàng)建的有效基準特征圖譜質量表征與中藥質量評價模式[15-16]，以確定具有降血糖藥效作用的甜葉菊飲片作為有效飲片基準，以具有降血糖活性[17]的特征代表性成分綠原酸及其含量作為質量表征基準點，采用課題組建立的甜葉菊飲片多指標性成分含量測定方法建立甜葉菊有效基準特征圖譜[18-20]，基于綠原酸對照品模擬基準點的有效基準特征圖譜質量表征信息建立評價甜葉菊飲片的質量標尺，對其準確性進行佐證，并以14批待評價飲片的實測信息與換算信息比較，進一步對基準質量表征信息的準確性與應用可行性進行佐證。最終建立了基于甜葉菊有效基準特征圖譜的質量表征模式，方法與質量評價應用，整體準確地表征甜葉菊飲片質量，為甜葉菊飲片的精準質量評價提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Watersalliance型高效液相色譜儀，Waters2998PDA檢測器，Empower軟件系統(tǒng)，自動進樣器；SartoriousBT25S型1/100000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；SartoriusBT124S型1/10000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(上海振捷實驗設備)；BuchiRotavaporR-220旋轉蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)。

1.2 試劑與試藥

甜葉菊飲片為菊科植物甜葉菊SteviarebaudianaBertoni的干燥葉，具體信息見表1，飲片標本現(xiàn)存于北京中醫(yī)藥大學中藥化學系，其中實驗樣品編號T2為課題組藥效試驗中確定有降血糖活性的甜葉菊飲片S14(有效飲片基準)，實驗樣品編號(Ti)與飲片信息編號(Si)不相對應。

TYJ-10(批號：201601-10-1)，實驗室自制，純度98%(歸一化法)；TYJ-14(批號：201601-14-3)，實驗室自制，純度98%(歸一化法)；紅景天苷(批號：130815)、異綠原酸A(批號：130815)、異綠原酸C(批號：120920)均購自成都普菲徳生物科技有限公司(純度≥98%)；異綠原酸B(批號：P15M10L88488)、綠原酸(批號：Y24J7K16726)、槲皮苷(批號：P19D10F106420)、木犀草苷(批號：Y13J10H93050)均購自上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%)；乙腈(色譜純)購自Fisher Scientific公司；甲醇(分析純)購自北京化工廠；磷酸(分析純)購自北京化學試劑公司；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司。

2 方法與結果

2.1 有效基準特征圖譜質量表征方法的建立

2.1.1 混合對照品溶液Ⅰ的制備 分別精密稱取TYJ-10、TYJ-14、紅景天苷、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮苷、木犀草苷對照品適量，用50%甲醇超聲溶解，定容，搖勻，配制成濃度為0.029 mg/mL的TYJ-10、0.0206 mg/mL的TYJ-14、0.0202 mg/mL的紅景天苷、0.0978 mg/mL的綠原酸、0.1568 mg/mL的異綠原酸A、0.0402 mg/mL的異綠原酸B、0.1138 mg/mL的異綠原酸C、0.0182 mg/mL的槲皮苷、0.0228 mg/mL的木犀草苷混合對照品溶液Ⅰ，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，備用。

2.1.2 甜葉菊飲片供試品溶液的制備 精密稱取干燥的甜葉菊基準飲片與待評價飲片粉末1 g(過二號篩)，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入50%甲醇溶液200 mL，超聲提取1次(功率500 W，頻率40 KHz)，20分鐘，過濾，減壓濃縮，轉移至100 mL容量瓶中，定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

表1 甜葉菊飲片信息表

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Waters XbridgeTMshield C18(4.6×250 mm，5 μm)；檢測波長：270 nm(紅景天苷、TYJ-10、TYJ-14)，330 nm(綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C)，254 nm(木犀草苷、槲皮苷)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸水(B)梯度洗脫，梯度洗脫條件見表2。

依據(jù)上述色譜條件，混合對照品及供試品溶液中9個有效指標性成分在各自檢測波長處與其他色譜峰分離度良好。按照以上色譜條件進樣得到的甜葉菊飲片基準、混合對照品的HPLC色譜圖見圖1。

圖1圖譜顯示：21個色譜峰在HPLC圖譜中顯示分離度良好，通過與TYJ-10、TYJ-14、紅景天苷、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮苷、木犀草苷對照品紫外吸收光譜對比，判斷9個特征峰對應的化學成分類型，涵蓋了苯乙醇類、酚酸類、黃酮類三種主要有效化學成分類型。

表2 梯度洗脫條件

注：A飲片基準(270 nm)；B對照品(270 nm)；C飲片基準(330 nm)；D對照品(330 nm)；E飲片基準(254 nm)；F對照品(254 nm)；3，7咖啡?？鼘幩犷悾?綠原酸；16異綠原酸A；18異綠原酸B；20異綠原酸C；9，10，11，12，14，15，17，21黃酮類；13木犀草苷；19槲皮苷；2紅景天苷；4 TYJ-10；5 TYJ-14；1，6其他類。

2.1.4 有效基準特征圖譜方法學考察 (1)精密度考察：按2.1.2項下制備甜葉菊飲片有效基準供試品溶液，按2.1.3項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以綠原酸為參照，計算各色譜峰與參比峰的相對峰面積和相對保留時間，結果顯示：相對峰面積RSD均小于等于2.07%，相對保留時間RSD均小于等于0.70%，表明儀器精密度良好，符合特征圖譜測定要求(RSD≤3%)[15-16]；(2)穩(wěn)定性考察：按2.1.2項下制備甜葉菊飲片有效基準供試品溶液，室溫放置，于制備后0、2、4、6、8、12、24小時按2.1.3項下色譜條件分別進樣測定，以綠原酸為參照，計算各色譜峰與參比峰的相對峰面積和相對保留時間，結果顯示：相對峰面積的RSD均小于等于2.20%，相對保留時間的RSD均小于等于1.39%，表明供試品溶液在24小時內(nèi)基本穩(wěn)定(RSD≤3%)[15-16]；(3)重復性考察：按2.1.2項下制備甜葉菊飲片有效基準供試品溶液6份，按2.1.3項下色譜條件分別進樣測定，以綠原酸為參照，計算各色譜峰與參比峰的相對峰面積和相對保留時間，結果顯示：相對峰面積的RSD均小于2.17%，相對保留時間的RSD均小于1.59%，表明此方法重復性良好(RSD≤3%)[15-16]。

2.1.5 特征指標性成分含量測定方法學考察 (1)線性關系考察：精密吸取2.1.1項下制備的混合對照品溶液Ⅰ，按2.1.3項下色譜條件分別進樣1 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL，測定9個代表性成分峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程及相關系數(shù)。結果表明：TYJ-10在0.0290～1.4500 μg、TYJ-14在0.0206～1.0300 μg、紅景天苷在0.0202～1.0100 μg、綠原酸在0.0978～4.8900 μg、異綠原酸A在0.1568～7.8400 μg、異綠原酸B在0.0402～2.0100 μg、異綠原酸C在0.1138～5.6900 μg、木犀草苷在0.0228～1.1400 μg、槲皮苷在0.0182～0.9100 μg范圍內(nèi)進樣量與峰面積呈良好的線性關系(R≥0.99)[15-16]。見表3。(2)精密度考察：按2.1.2項下制備甜葉菊飲片有效基準供試品溶液，按2.1.3項下色譜條件連續(xù)進樣6次測定，計算得到紅景天苷、TYJ-10、TYJ-14、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮苷、木犀草苷峰面積RSD均≤2.16%，表明儀器精密度良好，符合含量測定要求(RSD≤3%)[15-16]；(3)穩(wěn)定性考察：按2.1.2項下制備甜葉菊飲片有效基準供試品溶液，室溫放置，于制備后0、2、4、6、8、12、24小時按2.1.3項下色譜條件分別進樣測定，計算得到紅景天苷、TYJ-10、TYJ-14、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮苷、木犀草苷峰面積RSD均小于等于2.01%。表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD≤3%)[15-16]；(4)重復性考察：按2.1.2項下制備甜葉菊飲片有效基準供試品溶液6份，按2.1.3項下色譜條件分別進樣測定，計算得到紅景天苷、TYJ-10、TYJ-14、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、槲皮苷、異綠原酸C平均含量分別為0.0555%、0.1499%、0.1153%、0.4377%、0.1653%、0.1195%、1.0230%、0.1557%、0.3511%，RSD分別為0.74%、1.07%、2.05%、0.83%、1.79%、0.87%、1.81%、1.80%、2.44%，表明本方法重復性良好(RSD≤3%)[15-16]；(5)加樣回收率：精密稱取已知含量的甜葉菊飲片有效基準樣品6份，各約0.5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，按2.1.2項下方法制備有效基準供試品溶液；精密稱取紅景天苷對照品2.78 mg、TYJ-10對照品7.64 mg、TYJ-14對照品5.80 mg、綠原酸對照品21.80 mg、異綠原酸B對照品5.90 mg、異綠原酸A對照品52.50 mg、異綠原酸C對照品17.60 mg、木犀草苷對照品8.42 mg、槲皮苷對照品7.60 mg置于同一10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋到刻度搖勻，得到混合對照品溶液Ⅱ；精密量取1 mL混合對照品溶液Ⅱ分別置于以上6個100 mL供試品溶液中搖勻即得，按2.1.3項下色譜條件進樣，測定9個特征成分色譜峰峰面積，并計算紅景天苷、TYJ-10、TYJ-14、綠原酸、槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、槲皮苷、異綠原酸C加樣回收率分別為100.59%、98.64%、100.75%、100.21%、100.22%、100.41%、98.40%、101.35%、101.58%，RSD分別為1.23%、1.79%、1.63%、1.52%、1.50%、0.76%、1.42%、1.51%、1.50%，表明此方法準確可靠(回收率在95%～102%之間，RSD≤3%)[15-16]。見表4。

2.1.6 模擬基準點質量表征考察 以與檢測基準供試品溶液濃度(0.0438 mg/mL)等同的綠原酸對照品模擬飲片基準中質量表征基準點，即精密稱取2.19 mg綠原酸對照品加50%甲醇稀釋50倍，制得濃度為0.0438 mg/mL的綠原酸對照品溶液作為模擬基準點，按照2.1.3項下色譜條件進樣，測定對照品溶液和基準供試品溶液的出峰時間及色譜峰面積，結果見圖2。由圖2可知，基準供試品溶液中綠原酸即實測質量表征基準點保留時間23.027分鐘，峰面積為314637 μV·s/100 mg；綠原酸對照品溶液即模擬質量標準基準點的保留時間23.312分鐘，峰面積314844 μV·s/100 mg。二者保留時間、峰面積相對偏差絕對值均小于2%，二者相吻合，佐證了檢測方法的可行性與檢測結果的準確性，表明以0.0438 mg/mL的綠原酸對照品模擬質量表征基準點，對基準質量信息進行表征的方法準確可行。

表3 線性關系考察結果

表4 加樣回收率實驗結果

續(xù)表

圖2 模擬基準點HPLC色譜圖(330 nm)

2.2 有效基準特征圖譜質量表征信息

特征性成分質的表征及關聯(lián)分析，通過有效基準特征圖譜中特征峰的吸收光譜信息與對照品吸收光譜信息比對，推測其對應的化學成分類型，共指認出21個代表性成分，其中苯乙醇苷類成分3個，分別為紅景天苷、TYJ-10、TYJ-14；酚酸類成分6個，特征指標性成分為綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C；黃酮類成分10個，特征指標性成分為木犀草苷、槲皮苷；其他類型成分2個。21個色譜峰的保留時間、峰面積(以100 mg甜葉菊飲片計)、以模擬基準點為基準得到相對保留時間和相對峰面積以及9個特征性成分的含量、模擬相對含量、換算系數(shù)(代表性成分的相對含量/代表性成分的相對峰面積)。結果見表5。由表5可得，基于模擬基準點得到的21個特征峰及其模擬相對保留時間，模擬相對峰面積，9個代表性成分的模擬相對含量，即為甜葉菊飲片有效質量基準標尺。

2.3 評價與驗證

精密稱取14批待評價甜葉菊飲片，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，平行制備3份，按2.1.3項下色譜條件進樣檢測，得到的14批待評價甜葉菊質量表征信息，同時實測甜葉菊有效基準飲片各代表性成分含量，以檢驗基于有效質量基準標尺進行甜葉菊質量評價的準確性，結果見圖3～6。

由圖3～6可知，14批甜葉菊飲片特征圖譜皆含有21個相同的色譜峰，且14批甜葉菊飲片的21個特征峰相對保留時間均與基準標尺基本一致，同時也與實測值相吻合，結果表明14批飲片均為甜葉菊飲片，且驗證了應用有效基準標尺辨別甜葉菊飲片真?zhèn)蔚臏蚀_性。由圖7～8可得14批甜葉菊飲片質量表征信息，根據(jù)其特征峰相對峰面積及其相對含量高于其有效基準標尺對應點的數(shù)目、幅度和所涵蓋的三種主要化學類型及其綠原酸同類成分，綜合考量評價得出飲片T3，T6，T5，T1，T7，T15，T12質量較優(yōu)。

表5 21個特征峰的質量表征信息

圖3 14批甜葉菊飲片與基準飲片(T2)的HPLC特征圖譜(270 nm)

圖4 14批甜葉菊飲片與基準飲片(T2)的HPLC特征圖譜(330 nm)

圖5 14批甜葉菊飲片與基準飲片(T2)的HPLC特征圖譜(254 nm)

圖6 14批甜葉菊飲片與基準飲片(T2)的相對保留時間

注：A苯乙醇苷類成分；B酚酸類成分；C黃酮類成分。

圖8 14批甜葉菊飲片與基準飲片的相對含量

表6 14批甜葉菊飲片與基準飲片中9個特征代表性成分的含量(%，n=3)

由表6可得，換算含量與實測含量基本一致，即驗證了各代表性成分換算含量結果的準確性及其相對含量結果的準確性。

3 討論

本研究基于課題組前期建立的有效基準特征圖譜質量表征與中藥質量評價模式，建立了甜葉菊有效基準特征圖譜質量表征方法，甜葉菊飲片中21個特征峰涵蓋了苯乙醇類、黃酮類及酚酸類這三種主要化學類型成分，有研究證明綠原酸具有降血糖作用[17]，綜合考慮降血糖功效、保留時間、分離度及經(jīng)濟性，選用綠原酸作為質量表征基準點對特征性成分進行質量表征，采用所構建的甜葉菊質量評價模式及質量標尺對14批甜葉菊飲片的質量進行評價得出：T3、T6、T5、T1、T7、T15、T12質量較優(yōu)，且基于換算系數(shù)得到的9個代表性成分的含量皆與實測含量基本一致，驗證了本研究建立的基于甜葉菊有效基準特征圖譜的質量表征模式、方法能整體、準確地對甜葉菊飲片進行質量表征，且可以有效、精準、經(jīng)濟地評價甜葉菊飲片質量，從而為甜葉菊飲片的質量評價提供科學依據(jù)。