北方地區(qū)單中心Citrin蛋白缺陷所致嬰兒肝內(nèi)膽汁淤積癥23例臨床特征及基因分析

劉文雯，馬 昕，王美娟，寧慧娟，鐘雪梅

首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100020

近年來，隨著分子醫(yī)學(xué)及遺傳代謝相關(guān)的檢測技術(shù)的發(fā)展，嬰兒膽汁淤積癥的疾病譜正在發(fā)生轉(zhuǎn)變，各種基因突變引起的遺傳代謝性嬰兒膽汁淤積癥逐漸被認(rèn)識(shí)。希特林蛋白缺陷病(citrin deficiency，CD)為一種常染色體隱性遺傳疾病，最初在日本首次報(bào)道[1]，在亞洲國家多見。目前認(rèn)為有3種臨床類型：(1)Citrin蛋白缺陷所致的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥(neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency，NICCD)；(2)Citrin蛋白缺陷病導(dǎo)致的發(fā)育不良和血脂異常(failure to thrive and dyslipidemia caused by citrin deficiency，F(xiàn)TTDCD)[2]，是一種中間表型；(3)成人中作為復(fù)發(fā)性高氨血癥伴神經(jīng)精神癥狀的瓜氨酸血癥Ⅱ型(adult-onset type citrullinemia Ⅱ, CTLN 2)。NICCD是常見的引起嬰兒膽汁淤積的病因，占我國遺傳代謝病第2位[3]，僅次于甲基丙二酸尿癥，是我國嬰兒膽汁淤積性肝病重要病因。SLC25A13基因突變類型分布有明顯的地域差異，北方群體的SLC25A13等位基因異質(zhì)性明顯高于南方群體，既往關(guān)于我國NICCD的病例及相關(guān)基因報(bào)道多來自于南方地區(qū)，本文主要分析北方地區(qū)NICCD患兒的病例特點(diǎn)及基因突變情況。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年1月—2018年12月于首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院消化內(nèi)科住院，并經(jīng)血串聯(lián)質(zhì)譜、尿氣相色譜和/或基因檢測確診的23例NICCD患兒的臨床資料(NICCD組)。NICCD診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：(1)具有膽汁淤積的臨床表現(xiàn)；(2)血串聯(lián)質(zhì)譜和尿氣相色譜診斷；(3)基因檢測示SLC25A13突變。以上3條需符合2條方可診斷，或僅有(3)同時(shí)為純合或復(fù)合雜合致病性突變。同時(shí)收集與NICCD組同期的特發(fā)性肝內(nèi)膽汁淤積癥(idiopathic intrahepatic cholestasis, INC)患兒36例為INC組，即完善生化、病原、腹部影像學(xué)、血尿遺傳代謝篩查、代謝性肝病相關(guān)基因panel檢測等仍不能明確膽汁淤積病因的患兒。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料 收集患兒臨床資料，包括住院時(shí)年齡、性別、尿色、大便顏色改變情況、肝脾大程度、發(fā)病時(shí)間、出生史。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 收集患兒未經(jīng)系統(tǒng)治療前的血常規(guī)、生化、凝血、血?dú)夥治觥⒀?、甲胎蛋白、病原學(xué)檢查、甲狀腺功能檢測(對(duì)于多次檢測的項(xiàng)目取最高值)、血串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)分析以及尿氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)。

1.2.3 病理檢查 部分病例全麻下行腹腔鏡探查+膽道造影+肝活檢術(shù)，術(shù)中取肝組織HE染色后光鏡觀察。由本院病理科完成病理切片制作，由資深病理老師閱片并出具病理報(bào)告。

1.2.4 高通量基因測序檢測 住院期間留取患兒及父母外周血標(biāo)本2～3 ml，置于EDTA抗凝管保存。由北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所對(duì)膽汁淤積癥相關(guān)的目標(biāo)基因位點(diǎn)進(jìn)行高通量捕獲測序檢測分析。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究通過首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：SHERLL2020014?；純罕O(jiān)護(hù)人已充分知情并簽署書面知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 23例NICCD患兒中，籍貫均為長江以北，主要來自北京市、河北省、山東省、山西?。荒信壤秊?6∶7，均為足月兒，但出生體質(zhì)量偏低，平均體質(zhì)量為(2912.00±486.55)g。伴有肝外畸形者5例(21.7%)，包括房間隔缺損2例，馬蹄腎、腎盂腎盞擴(kuò)張、隱性脊柱裂各1例。36例INC患兒中，男女比例為26∶10，其中<35周的早產(chǎn)兒占4例，平均體質(zhì)量為(2878.00±523.49)g，肝外畸形4例，分別為房間隔缺損、小腸閉鎖、十二指腸發(fā)育不良、左室假腱索各1例。臨床表現(xiàn)比較詳見表1。

表1 NICCD組與INC組臨床表現(xiàn)比較

2.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 23例NICCD患兒中，伴有低血糖患兒10例，伴有低白蛋白血癥患兒13例，伴有高血氨患兒17例，伴有高乳酸患兒15例；血脂指標(biāo)中，15例LDL升高，6例TC升高，7例TG升高；凝血功能方面，17例PT延長，16例患兒活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)延長。與INC組對(duì)比，NICCD組GGT、TBA、APTT明顯高于INC組，Alb較INC組為低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 NICCD組與INC組實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果對(duì)比

2.3 病理學(xué)檢查 3例NICCD患兒完善肝組織活檢，2例表現(xiàn)為肝細(xì)胞及毛細(xì)膽管淤膽，不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變，可見點(diǎn)灶樣壞死、融合灶樣壞死；匯管區(qū)輕度擴(kuò)大；其中1例肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見假小葉形成，散可見吞噬色素顆粒的Kupffer細(xì)胞，病變相當(dāng)于G3S4。1例主要表現(xiàn)為匯管區(qū)小膽管數(shù)量稀小，管腔狹小。

2.4 血MS-MS和尿GC-MS檢測 23例NICCD患兒中，共21例完成血MS-MS檢測，主要表現(xiàn)為蛋氨酸、瓜

氨酸、精氨酸和游離?；鈮A(CO)及長鏈酰基肉堿(C14、C16、C18∶1、C18∶2)的升高，通過血MS-MS檢測診斷NICCD 10例，占47.6%(10/21)。18例完善了尿GC-MS檢測，主要表現(xiàn)為半乳糖、半乳糖酸、半乳糖醇、4-羥基苯乳酸排泄增加。

2.5 基因檢測分析 在23例患兒中復(fù)合雜合突變9例，純合突變7例，7例為雜合突變(表3)。共檢測到16種突變類型，其中IVS14-9A>G、c1640 G>A、c.762T>A、c.736delG、c.1098 T del、c.851G>A、c.550G>A為新發(fā)現(xiàn)突變。其中10例進(jìn)行了父母驗(yàn)證，其中1例患兒父親為c.615+5G>A純合突變，余均為單個(gè)位點(diǎn)突變(表3)。病例6患兒為c.852_855del/IVS16ins3kb復(fù)合雜合突變，c.852_855del，導(dǎo)致氨基酸改變p.R284fs，為移碼突變，突變來源于母親，父親該位點(diǎn)無變異；IVS16ins3kb經(jīng)PCR擴(kuò)增示先證者及父親發(fā)生突變，母親未發(fā)生突變(圖1、2)。病例7患兒為c.852_855del/c.615+5G>A復(fù)合雜合突變，c.852_855del(p.R284fs)突變來源于母親，父親該位點(diǎn)無變異；c.615+5G>A(splicing)為剪切突變，受檢人之父該位點(diǎn)純合變異，受檢人之母該位點(diǎn)無變異(圖3)。

注：1，陰性對(duì)照；2，陽性對(duì)照；3，患兒；4，患兒父親；5，患兒母親。

表3 23例NICCD患兒一般情況及SLC25A13基因突變檢測結(jié)果

注：a，先證者雜合突變；b，父親無變異；c，母親雜合突變。

注：a，先證者雜合突變；b，父親純合突變；c，母親無變異。

2.6 治療與轉(zhuǎn)歸 所有患兒入院后即予保肝利膽治療、對(duì)癥補(bǔ)充脂溶性維生素、調(diào)節(jié)腸道菌群、更換至無乳糖并強(qiáng)化中鏈脂肪酸奶粉喂養(yǎng)等，部分合并感染患兒使用抗生素治療，合并有巨細(xì)胞病毒感染者同時(shí)予以更昔洛韋抗病毒治療。2例患兒失訪，21例患兒經(jīng)過治療2～6個(gè)月后轉(zhuǎn)氨酶及膽紅素水平逐漸恢復(fù)正常，隨訪至1歲，患兒均無生長發(fā)育落后，其中2例患兒出現(xiàn)飲食偏好(喜食魚類、肉類，不喜主食)。1例患兒2歲8月齡并發(fā)膽總管結(jié)石合并急性胰腺炎。

3 討論

CD是由SLC25A13基因突變導(dǎo)致的一種常染色體隱性遺傳疾病，致病基因SLC25A13 位于染色體7q21.3上，編碼 Citrin 蛋白[1]。Citrin蛋白功能缺失時(shí)，NADH含量升高，NADH/NAD+比值升高，引起一系列代謝改變。同時(shí)，ATP產(chǎn)量減少，造成肝細(xì)胞能量缺乏[5]。

NICCD是我國嬰兒膽汁淤積性肝病重要病因。本研究中23例NICCD中，均為嬰兒期起病，其中新生兒期起病占56.5%，臨床表現(xiàn)為不同程度的皮膚黃染、深色尿、排黃色或淺黃色大便，有13%患兒有一過性白陶土樣大便，提示NICCD患兒亦可伴有嚴(yán)重的膽汁排泄障礙。其生化主要表現(xiàn)為膽紅素及酶學(xué)指標(biāo)的異常，同時(shí)發(fā)現(xiàn)膽紅素及轉(zhuǎn)氨酶兩者的升高程度呈正線性相關(guān)，因線粒體功能障礙，蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，ATP產(chǎn)生減少，而膽小管膜上依賴ATP的載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素發(fā)生障礙，造成嚴(yán)重膽汁淤積，從而加重肝細(xì)胞損害，造成惡性循環(huán)。轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)中AST升高幅度較ALT顯著，因AST主要存在于肝細(xì)胞線粒體中，而ALT主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，因Crtrin缺陷癥線粒體功能障礙，受損嚴(yán)重，故肝細(xì)胞膜被破壞后血AST升高較ALT更為明顯。同時(shí)伴有高乳酸、血氨輕度升高、低血糖、凝血功能異常、血脂異常，這與CD所引起的糖、脂肪、氨基酸代謝異常有關(guān)。NICCD組GGT、TBA、APTT明顯高于INC組，Alb較INC組低(P值均<0.05)，表明上述指標(biāo)可起到鑒別NICCD的作用。

血MS-MS及尿GC-MS對(duì)于CD具有重要診斷意義。本研究中CD患兒的血MS-MS檢測主要表現(xiàn)為蛋氨酸、瓜氨酸、精氨酸不同程度的升高；除上述改變外，還有游離肉堿及長鏈酰基肉堿代謝異常，此為肝功能異常或膽汁淤積的非特異性改變，無明確指向性，本研究中，其陽性診斷率為47.6%(10/21)，較之前學(xué)者報(bào)道[6]的32.7%稍高。部分病例血、尿代謝篩查未見異常，提示其具有一過性，曾有研究報(bào)道[7-8]指出，血氨基酸異常只出現(xiàn)在疾病前2個(gè)月。其尿GC-MS檢測多表現(xiàn)為半乳糖、半乳糖醇、半乳糖酸、4-羥基苯乳酸的增高，與既往報(bào)道一致[9]。NICCD新生兒篩查敏感性較低可能與采血時(shí)間過早其代謝譜特征尚未明顯呈現(xiàn)有關(guān)，這為本病早期診斷增加了難度。

目前已報(bào)道SLC25A13基因變異100余種，最常見的突變類型為缺失突變、錯(cuò)義突變、無義突變及剪接位點(diǎn)突變。我國報(bào)道了多種致病突變類型，包括大片段重復(fù)/缺失，Zhang等[10]通過單核苷酸多態(tài)性分析及半定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)包含啟動(dòng)子及外顯子1的21.7 kb缺失，完全抑制了其轉(zhuǎn)錄及翻譯，是目前發(fā)現(xiàn)的最長片段缺失。我國NICCD基因突變類型以c.851_854del(占58.41%)、c.1638_1660dup23(8.85%)、c.IVS6+5G>A(8.41%)和IVS16ins3kb(7.52%)最常見，該4種突變型在我國南方占比(87.9%)大于北方(63.6%)[11-12],并且北方群體的SLC25A13等位基因異質(zhì)性明顯高于南方群體[13]。

本研究23例CD患兒中，包括插入突變、缺失突變、剪切位點(diǎn)突變及錯(cuò)義突變，其中高頻突變c.851_854del4占3例，c.852_855del4占5例，IVS16ins3kb占3例，c.1194A>G占5例；但未見c.1638_1660dup23的突變類型，考慮與標(biāo)本量少及地域性有關(guān)。其中新發(fā)現(xiàn)突變7種，通過多種預(yù)測軟件均提示其合成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為不利蛋白。多種突變類型也證實(shí)了北方群體等位基因的高異質(zhì)性。本次研究中7例為單基因雜合突變，鑒于本次高通量基因測序檢測方式的局限性，是否存在大片段的插入/缺失突變或尚未發(fā)現(xiàn)的致病突變，還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究中病例5患兒合并膽總管結(jié)石伴急性胰腺炎。其6月齡診斷NICCD，基因突變類型為c.852_855TATCdel /c.550G>A的復(fù)合雜合突變，予對(duì)癥保肝利膽治療后約9月齡肝功能正常；2歲8個(gè)月出現(xiàn)急性腹痛癥狀，血生化示：血淀粉酶411 U/L，ALT 70.4 U/L, AST 49.2 U/L，膽紅素正常，甘油三酯 2.56 mmol/l，腹部影像學(xué)檢查提示膽總管結(jié)石征象伴胰腺腫脹，遂行ERCP下膽總管取石術(shù)以及胃鏡引導(dǎo)下鼻-空腸管放置術(shù)，術(shù)后予鼻飼泵奶15 d，并逐漸過渡至經(jīng)口喂養(yǎng)。隨訪患兒至今，目前5歲，生長發(fā)育正常，無特殊飲食偏好，肝功能正常?；純菏欠癜l(fā)展至FTTDCD還需進(jìn)一步隨訪監(jiān)測。

病例6患兒的突變類型為第9外顯子c.852_855del和第16內(nèi)含子IVS16ins3kb的復(fù)合雜合突變，較為罕見，在國內(nèi)僅有6例報(bào)道[14]，本例患兒的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能以及其對(duì)臨床預(yù)后的影響還需進(jìn)一步研究，隨訪患兒目前1歲4個(gè)月，生長發(fā)育正常，無明顯飲食偏好，檢測肝功能正常。

NICCD治療主要為保肝利膽、脂溶性維生素補(bǔ)充以及無乳糖并含豐富的中鏈脂肪酸的特殊配方奶粉治療，飲食治療的效果已在許多病例報(bào)告中得到證實(shí)。NICCD一般預(yù)后良好，癥狀可能在1歲時(shí)自行消退，但越來越多預(yù)后不良的病例相繼被報(bào)道，張建玲等[15]曾報(bào)道1例以肝硬化腹腔積液起病的NICCD患兒。本研究23例中，隨訪的21例患兒病情均于1歲內(nèi)好轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)氨酶及膽紅素水平正常，無生長發(fā)育落后，其中2例患兒存在飲食偏好，關(guān)于病情是否進(jìn)一步發(fā)展至Citrin蛋白缺乏癥導(dǎo)致的FTTDCD還需進(jìn)一步隨訪監(jiān)測。存在肝外畸形的5例患者轉(zhuǎn)歸亦良好，目前未找到肝外畸形影響預(yù)后的直接證據(jù)。

綜上所述，NICCD在嬰兒膽汁淤積癥中并不少見，臨床醫(yī)師需加強(qiáng)重視，對(duì)于臨床上高度懷疑的病例應(yīng)盡快行血尿遺傳代謝性篩查，必要時(shí)完善基因檢測。早期診斷，及時(shí)干預(yù)，同時(shí)對(duì)于1歲內(nèi)病情緩解的患兒亦需長期進(jìn)行隨訪，避免發(fā)展至FTTDCD甚至是CTLN2。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉文雯負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；馬昕、王美娟、寧慧娟參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；鐘雪梅負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。