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    AMPK激動(dòng)劑預(yù)處理對肝缺血再灌注損傷大鼠模型的影響及相關(guān)機(jī)制

    2021-05-17 10:01:12潘寧波張旭陽楊龍燦李繼維唐天豪
    臨床肝膽病雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:磷酸化肝細(xì)胞通路

    潘寧波,張旭陽,張 玉,楊龍燦,余 曦,李繼維,唐天豪,黃 平,張 瑩

    1 貴州省人民醫(yī)院 a.肝膽外科,b.信息科,貴陽 550000; 2 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,貴州 遵義 563000; 3 銅仁市人民醫(yī)院 肝膽外科,貴州 銅仁 554300;4 畢節(jié)市第一人民醫(yī)院 肝膽外科,貴州 畢節(jié) 551700

    肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)是肝外科手術(shù)中難以避免且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,嚴(yán)重阻礙了肝臟手術(shù)在臨床中的發(fā)展。有研究[1]發(fā)現(xiàn),HIRI過程中必然伴隨能量代謝的紊亂,而腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路作為一種維持生物能量穩(wěn)定、平衡的調(diào)節(jié)器將發(fā)揮重要作用。同時(shí)有研究表明,AMPK信號(hào)通路在心[2]、腦[3]、腎[4]、肝[5]等重要器官的缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。因此,本研究使用5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)預(yù)處理,初步探討AMPK信號(hào)通路改變對大鼠HIRI的影響及可能機(jī)制,為減輕HIRI提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 54只健康SPF級(jí)SD雄性大鼠[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2015-0001;使用許可證編號(hào):SYXK(黔)2018-0001],4~8周齡,220~250 g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。三磷酸腺苷(ATP)、TNFα和IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑盒購自美國Ambion公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑均購自日本TaKaRa公司。AICAR購自美國APExBIO公司。磷酸化AMPK、磷酸化mTOR及內(nèi)參抗體(GAPDH)均購自美國CST,磷酸化GLUT4購自英國Abcam,MRP2抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

    1.2 動(dòng)物分組和模型建立 54只雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)平均分為3組,每組18只。實(shí)驗(yàn)組:術(shù)前1 h腹腔注射AICAR,500 mg/kg;對照組及假手術(shù)組:術(shù)前1 h使用0.9%氯化鈉注射液(500 mg/kg)腹腔注射。HIRI模型建立(實(shí)驗(yàn)組和對照組):依照Pringle法建立HIRI模型。麻醉大鼠,取腹部正中切口,逐層進(jìn)入腹腔,進(jìn)腹后暴露第一肝門,用無創(chuàng)血管夾阻斷肝臟全部血流,阻斷30 min后松開無創(chuàng)血管夾,使血流重新灌注,關(guān)腹。假手術(shù)組與HIRI模型同法進(jìn)腹,僅暴露第一肝門,30 min后關(guān)腹。將各組手術(shù)后大鼠置于干燥清潔的鼠籠等待蘇醒。于血流重新恢復(fù)灌注術(shù)后12、24、72 h每組隨機(jī)取6只大鼠,留取血清,存放于-20 ℃冰箱備用;剪取整個(gè)肝左葉,一部分用甲醛固定,另一部分置于液氮速凍儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

    1.3 肝組織病理HE染色 取肝組織用甲醛固定,然后脫水、包埋制作石蠟切片,光鏡下觀察肝損傷情況。

    1.4 大鼠血清指標(biāo)檢測 取大鼠血清,送貴陽市金陽醫(yī)院檢驗(yàn)科使用全自動(dòng)生化分析儀檢測ALT、AST和TBil濃度。于-20 ℃冰箱取出待測血清,按照ELISA試劑盒說明書檢測TNFα和IL-6。

    1.5 大鼠肝組織ATP檢測 大鼠肝組織100 mg,加入裂解液充分研磨勻漿取上清液,按照ATP試劑盒說明書要求檢測。

    1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time-PCR)檢測 取100 mg肝組織,按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA并檢測其濃度跟純度,接著將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后進(jìn)行real time-PCR。使用兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序:第一步95 ℃ 2 min,1個(gè)循環(huán);第二步 95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,39個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。結(jié)果分析:以GAPDH為內(nèi)參,2-△△CT相對定量法計(jì)算相對表達(dá)量。引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.7 Western Blot檢測 取肝組織50 mg,加入蛋白裂解液冰上研磨提取總蛋白,用BCA法測總蛋白濃度;制備電泳上樣樣品并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩V谱鞣蛛x膠,取50 μg 蛋白上樣后電泳,轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上,封閉液封閉2 h。加入一抗磷酸化AMPK(1∶1000)、磷酸化mTOR(1∶1000)、磷酸化GLUT4(1∶2000)、MRP2(1∶800)、GAPDH(1∶1000)4 ℃孵育過夜。加入二抗室溫下孵育2 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影曝光。Image lab 5.0凝膠圖像分析系統(tǒng)計(jì)算條帶的灰度值。

    1.8 倫理學(xué)審查 本研究已通過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查,批號(hào):[2019]094號(hào)。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠肝組織HE染色結(jié)果 大鼠肝缺血再灌注后12、24、72 h,假手術(shù)組的肝小葉及肝細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常,匯管區(qū)結(jié)構(gòu)完整。缺血再灌注后12 h,對照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較假手術(shù)組紊亂,肝索斷裂,部分肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫、空泡樣變性及少許壞死導(dǎo)致的氣球樣變,中央靜脈及肝血竇擴(kuò)張、充血,肝索斷裂,實(shí)驗(yàn)組輕于對照組。缺血再灌注后24 h,對照組與實(shí)驗(yàn)組肝組織損傷較12 h加重,對照組見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂進(jìn)一步加重,肝細(xì)胞水腫、空泡樣變性及壞死增多,中央靜脈及肝血竇擴(kuò)張、充血明顯,匯管區(qū)可見少許炎癥細(xì)胞浸潤,實(shí)驗(yàn)組輕于對照組。缺血再灌注后72 h,對照組與實(shí)驗(yàn)組肝組織損傷程度明顯較24 h減輕,對照組肝細(xì)胞水腫、壞死減少,中央靜脈、肝血竇擴(kuò)張及充血減輕,實(shí)驗(yàn)組肝損傷減輕程度明顯優(yōu)于對照組(圖1)。

    圖1 各組大鼠肝組織HE染色結(jié)果(×200)

    2.2 各組大鼠血清指標(biāo)比較 術(shù)后12、24、72 h,對照組ALT、AST、TBil、TNFα、IL-6均高于實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組(P值均<0.05),實(shí)驗(yàn)組各指標(biāo)均高于假手術(shù)組(P值均<0.05)(表2)。

    同組比較:術(shù)后24 h,對照組和實(shí)驗(yàn)組ALT、AST、TBil、TNFα、IL-6高于術(shù)后12 h(P值均<0.05);術(shù)后72 h,實(shí)驗(yàn)組和對照組各指標(biāo)均較術(shù)后24 h下降,但高于術(shù)后12 h(P值均<0.05)(表2)。

    表2 三組大鼠術(shù)后12、24、72 h血清指標(biāo)水平比較

    2.3 各組大鼠ATP水平比較 術(shù)后12、24、72 h,實(shí)驗(yàn)組肝組織ATP水平均高于對照組和假手術(shù)組,對照組均低于假手術(shù)組(P值均<0.05)(表3)。

    同組比較:實(shí)驗(yàn)組術(shù)后24 h ATP水平高于術(shù)后12 h,而術(shù)后72 h低于24 h(P值均<0.05);對照組術(shù)后24 h ATP水平高于術(shù)后12 h,而術(shù)后72 h高于術(shù)后12 h(P值均<0.05)(表3)。

    表3 三組大鼠術(shù)后12、24、72 h肝ATP水平比較

    2.4 各組大鼠AMPK、mTOR、GLUT4、MRP2 mRNA水平比較 術(shù)后12、24、72 h,實(shí)驗(yàn)組AMPK、GLUT4、MRP2的mRNA相對表達(dá)水平均高于對照組和假手術(shù)組,對照組AMPK mRNA相對表達(dá)水平高于假手術(shù)組,對照組GLUT4、MRP2 mRNA相對表達(dá)水平均低于假手術(shù)組(P值均<0.05);實(shí)驗(yàn)組mTOR mRNA相對表達(dá)水平均低于對照組和假手術(shù)組,對照組高于假手術(shù)組(P值均<0.05)。

    同組比較:對照組和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后24 h,AMPK、GLUT4、MRP2、mTOR mRNA相對表達(dá)水平均高于術(shù)后12 h(P值均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后72 h,AMPK、GLUT4、MRP2mRNA相對表達(dá)水平均低于術(shù)后24 h,高于術(shù)后12 h,而mTOR mRNA相對表達(dá)水平高于24 h(P值均<0.05);對照組術(shù)后72 h,AMPK、mTOR mRNA相對表達(dá)水平均低于術(shù)后24 h,高于術(shù)后12 h,而GLUT4、MRP2 mRNA相對表達(dá)水平均高于術(shù)后24 h(P值均<0.05)(表4)。

    表4 三組大鼠術(shù)后12、24、72 h各蛋白mRNA相對表達(dá)水平比較

    2.5 各組大鼠AMPK、mTOR、GLUT4、MRP2蛋白表達(dá)水平比較 術(shù)后12、24、72 h,實(shí)驗(yàn)組磷酸化AMPK、磷酸化GLUT4、MRP2表達(dá)水平均高于對照組和假手術(shù)組,對照組磷酸化AMPK表達(dá)水平高于假手術(shù)組,對照組磷酸化GLUT4、MRP2表達(dá)水平均低于假手術(shù)組(P值均<0.05);實(shí)驗(yàn)組磷酸化mTOR表達(dá)水平均低于對照組和假手術(shù)組,對照組高于假手術(shù)組(P值均<0.05)(圖2,表5)。

    同組比較:實(shí)驗(yàn)組術(shù)后72 h磷酸化AMPK、磷酸化GLUT4、MRP2表達(dá)水平均低于術(shù)后24 h,高于術(shù)后12 h,而磷酸化mTOR高于術(shù)后24 h(P值均<0.05);對照組術(shù)后72 h磷酸化AMPK表達(dá)水平低于術(shù)后12、24 h,磷酸化mTOR表達(dá)水平低于術(shù)后24 h而高于術(shù)后12 h(P值均<0.05),而磷酸化GLUT4、MRP2表達(dá)水平均高于24 h(P值均<0.05)(圖2,表5)。

    表5 三組大鼠術(shù)后12、24、72 h各蛋白相對表達(dá)水平比較

    圖2 三組大鼠術(shù)后12、24、72 h各蛋白相對表達(dá)結(jié)果

    3 討論

    HIRI是一種涉及諸多因素、眾多環(huán)節(jié)且機(jī)制非常復(fù)雜的病理生理過程。目前的研究[6-8]發(fā)現(xiàn),炎癥細(xì)胞因子、能量代謝紊亂、微循環(huán)障礙等參與了HIRI。因此,最大程度減輕HIRI是肝膽外科臨床工作和實(shí)驗(yàn)研究亟待解決的問題。

    AMPK是生物體內(nèi)維持生物能量穩(wěn)定、平衡的一種重要信號(hào)通路。已有研究[9-12]證實(shí),HIRI時(shí),機(jī)體攝取葡萄糖能力下降,糖酵解途徑、代謝途徑被抑制,mTOR信號(hào)通路被激活,ATP合成能力下降,導(dǎo)致機(jī)體能量供給不足,降低了MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素能力,損傷肝細(xì)胞功能,加重肝炎癥反應(yīng)。因此,本實(shí)驗(yàn)使用AICAR預(yù)處理激活A(yù)MPK信號(hào)通路,進(jìn)一步使其下游分子mTOR失活、GLUT4活化,ATP合成增加,促使MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素而減輕HIRI。

    本實(shí)驗(yàn)中,對照組在HIRI早期(術(shù)后12 h)血清AST、ALT、TBil、TNFα、IL-6和mTOR mRNA及其蛋白較實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組表達(dá)水平上升,而AMPK、GLUT4、MRP2 mRNA及其蛋白較實(shí)驗(yàn)組和假手術(shù)組表達(dá)降低,ATP合成下降,肝組織和肝細(xì)胞功能出現(xiàn)損傷,此時(shí)能量合成障礙;在HIRI中期(術(shù)后24 h),血清AST、ALT、TBil、TNFα、IL-6和mTOR mRNA及其蛋白表達(dá)水平持續(xù)上升,AMPK、GLUT4、MRP2表達(dá)水平持續(xù)下降,肝組織和肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重,提示能量合成嚴(yán)重不足;在HIRI后期(術(shù)后72 h),各指標(biāo)變化開始回升,說明肝臟開始恢復(fù)自身代謝與合成。而使用AICAR預(yù)處理后,無論在HIRI早期、中期,還是晚期,實(shí)驗(yàn)組肝組織和肝功能損傷程度均輕于對照組,血清AST、ALT、TBil、TNFα、IL-6和mTOR mRNA及其蛋白表達(dá)均低于對照組,ATP合成和AMPK、GLUT4、MRP2 mRNA及其蛋白變化均高

    于對照組,說明AMPK活化后,抑制了下游分子mTOR表達(dá),上調(diào)了下游分子GLUT4表達(dá)。有研究[10]證實(shí),AMPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)肝組織中的GLUT4表達(dá)起著重要作用,與GLUT4的表達(dá)呈正相關(guān),而GLUT4是主要轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的分子之一,影響肝臟、骨骼肌對葡萄糖的攝取、利用以及全身能量供應(yīng),能夠改善糖代謝,提高能量生成,促進(jìn)肝細(xì)胞功能快速恢復(fù)。另外,MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素是一個(gè)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、耗能的過程,其表達(dá)高低與能量呈正相關(guān)[12]。mTOR信號(hào)通路被激活,ATP合成能力下降,導(dǎo)致機(jī)體能量供給不足[13],降低了MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素能力,加重肝臟炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)組AICAR通過作用于α亞基中Thr-172位點(diǎn)而激活A(yù)MPK信號(hào)通路,使其下游分子mTOR失活、GLUT4活化,ATP合成增加,促使MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)膽紅素,減輕肝細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)中,隨著HIRI后時(shí)間的推移,機(jī)體逐漸恢復(fù)供能,炎癥因子逐漸被清除,肝損傷逐漸減輕,提示能量代謝途徑能減輕肝臟炎癥反應(yīng),降低HIRI程度。通過AICAR預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組則更能促進(jìn)肝臟自身合成與代謝的恢復(fù),進(jìn)而減輕HIRI。

    綜上所述,AICAR預(yù)處理能激活A(yù)MPK信號(hào)通路,改善能量代謝途徑,減輕肝臟炎癥反應(yīng),從而降低HIRI程度。

    利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:潘寧波負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),資料分析,撰寫論文;張旭陽、張玉、楊龍燦、余曦、李繼維、唐天豪參與收集數(shù)據(jù),修改論文;黃平、張瑩負(fù)責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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